選擇性檢測細胞內(nèi)還原性物質(zhì)熒光探針的合成及其生物應(yīng)用.pdf

1、硫醇是生物體中許多蛋白質(zhì)和小分子的重要組成部分，在細胞的抗氧化系統(tǒng)中具有重要的作用。細胞內(nèi)硫醇的水平與白細胞缺失、牛皮癬、肝損傷、癌癥以及艾滋病等許多疾病有著直接的聯(lián)系。對細胞內(nèi)硫醇類物質(zhì)的檢測有助于闡明還原體系在整個細胞氧化還原網(wǎng)絡(luò)的重要調(diào)控作用。近年來，檢測細胞內(nèi)硫醇類物質(zhì)的研究越來越多，其中熒光法簡單易行，便于操作，具有高靈敏度、高選擇性和廣泛可用的熒光染料等特點。更加吸引人的是探針分子可以在不破壞生物活性的情況下進入細胞，與活細

2、胞內(nèi)的硫醇結(jié)合生成強熒光物質(zhì)，并借助于激光共聚焦成像技術(shù)，實現(xiàn)細胞內(nèi)硫醇的“可視化”，從而對它們在生命體內(nèi)進行“實時在線”的檢測。
　　目前，用于檢測生物體內(nèi)硫醇的熒光探針發(fā)展迅速，然而能夠用于生理條件下實時快速檢測硫醇的熒光探針少有報道，因此我們的主要目的在于設(shè)計高選擇性、高靈敏度的，能夠快速檢測細胞內(nèi)硫醇的熒光探針。本論文基于熒光探針與硫醇類物質(zhì)特異性作用后熒光光譜性質(zhì)的改變從而實現(xiàn)對其的檢測。本文主要開展了以下兩方面的研究工

3、作:
　　(一)基于馬來酰亞胺基團對巰基的特異性響應(yīng)，以吖啶衍生物為母體設(shè)計合成了一種新的含有兩個馬來酰亞胺基團、可以快速檢測非蛋白硫醇的熒光探針。探針本身熒光較弱，與非蛋白硫醇以1:2的比例反應(yīng)后熒光增強明顯，激發(fā)和發(fā)射波長分別位于380nm和440nm。由于探針分子中兩個馬來酰亞胺基團是鄰位取代的，空間距離很近，當探針與蛋白硫醇以1:1的比例反應(yīng)之后，受體積較大的蛋白硫醇影響，未反應(yīng)的馬來酰亞胺基團空間位阻變大，很難繼續(xù)與其他

4、蛋白硫醇反應(yīng)，從而繼續(xù)猝滅母體熒光團的熒光，導(dǎo)致探針熒光無法恢復(fù)，因此探針對蛋白硫醇沒有響應(yīng)；非蛋白硫醇由于體積較小，可以與探針分子以2:1的比例反應(yīng)而使探針熒光明顯增強。在室溫、生理 pH值條件下探針能夠快速檢測非蛋白硫醇，1.5μM探針與1.0μM谷胱甘肽在小于1 min內(nèi)即反應(yīng)結(jié)束，蛋白硫醇、生物體內(nèi)的活性氧、金屬離子及其他抗氧化劑均對測定沒有干擾。在1.0×10-8-1.5×10-6 M范圍內(nèi)谷胱甘肽的濃度與熒光強度呈良好的線性

5、關(guān)系，方法的檢測限為7.7nM。為了比較兩個馬來酰亞胺基團之間的空間距離對反應(yīng)速率的影響，本文同時合成了間二馬來酰亞胺取代的化合物作為對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個巰基響應(yīng)基團處于間位時與非蛋白硫醇反應(yīng)速率比鄰位時速率慢很多，推測是由于鄰位取代時兩個取代基團空間距離太近而存在空間位阻效應(yīng)(空間位阻效應(yīng)可以使反應(yīng)速率加快)，使得探針本身能量較高而不如間位取代的化合物穩(wěn)定，從而更易與谷胱甘肽反應(yīng)。實驗過程中發(fā)現(xiàn)探針溶液在室溫下放置三周后，溶液顏色由淺黃