新型細(xì)胞內(nèi)信息分子熒光檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)、合成與性能研究.pdf

1、生物活性小分子如活性硫族(RSS)、活性氧族(ROS)、活性氮族(RNS)等，在生物體內(nèi)具有至關(guān)重要的作用。這些微量存在的生物小分子在體內(nèi)保持著復(fù)雜而精細(xì)的動(dòng)態(tài)平衡，并參與調(diào)節(jié)各種生化、生理過(guò)程，對(duì)維持生命體的健康發(fā)展起著不可或缺的作用。它們?cè)谏矬w內(nèi)的含量異常波動(dòng)（升高或降低）與一些疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，檢測(cè)這些生物活性分子對(duì)探討相關(guān)分子參與的生理病理過(guò)程、闡釋其與相關(guān)疾病的關(guān)系，以及研究生物信號(hào)傳輸通路和復(fù)雜環(huán)境下生物網(wǎng)絡(luò)

2、的運(yùn)作過(guò)程等顯得尤為重要。近年來(lái)發(fā)展的熒光技術(shù)，以其簡(jiǎn)便、快捷、靈敏、無(wú)損檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)成為研究熱點(diǎn)。而開發(fā)靈敏性高、選擇性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、生物相容性優(yōu)良，新型的熒光探針是研究者們共同面臨的課題。
　　硫化氫(H2S)是繼NO、CO之后發(fā)現(xiàn)的第三種生物信息分子，目前，圍繞H2S的靈敏性檢測(cè)引起探針研究領(lǐng)域的極大關(guān)注。本文基于相關(guān)機(jī)制設(shè)計(jì)、合成了三類硫化氫熒光探針，探針結(jié)構(gòu)均通過(guò)1H-NMR，13C-NMR，HR-MS等波譜方法確認(rèn)。Pr

3、obe1是基于硫化氫分子雙親核加成反應(yīng)的“On-Off”型熒光探針，其制備方法簡(jiǎn)便，原料易得。該探針能夠在緩沖溶液下識(shí)別硫化氫分子，檢測(cè)限達(dá)到0.12 M，特別是，該探針在活細(xì)胞內(nèi)能夠選擇性識(shí)別硫化氫分子，該識(shí)別過(guò)程通過(guò)激光共聚焦實(shí)驗(yàn)得以驗(yàn)證。作者采用核磁滴定與質(zhì)譜研究了Probe1識(shí)別硫化氫的作用機(jī)制，首次提出羅丹明體系中硫化氫與醛基反應(yīng)生成含硫半縮醛由于H2S的雙親核性進(jìn)一步親核加成關(guān)環(huán)的識(shí)別機(jī)制。另外，本文利用硫化氫親核加成二硫鍵

4、的反應(yīng)機(jī)制，設(shè)計(jì)、合成了三個(gè)不同發(fā)射波長(zhǎng)的熒光探針，拓展了二硫鍵結(jié)構(gòu)在硫化氫檢測(cè)探針設(shè)計(jì)中的應(yīng)用。分別采用了單羥基大黃素，4-甲基-7-羥基香豆素，4-羥基氟硼吡咯作為報(bào)告熒光團(tuán)，合成了三種熒光探針，Probe2，Probe3，Probe4，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Probe4響應(yīng)性更快，而Probe3的檢測(cè)限最低，熒光量子產(chǎn)率更高，能較好的應(yīng)用于細(xì)胞中硫化氫的檢測(cè)。而NBD綴合羥基萘酰亞胺的Probe5是基于硫化氫硫解苯醚鍵的作用機(jī)制。Prob

5、e5在緩沖溶液中的檢測(cè)限為0.44 M，該探針也成功應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞中外源性硫化氫。
　　谷胱甘肽是腫瘤細(xì)胞內(nèi)高含量的含巰基分子，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)其高靈敏檢測(cè)，本文基于谷胱甘肽與醛基的特殊反應(yīng)機(jī)制設(shè)計(jì)了一種新型“Off-On”熒光探針Probe6。通過(guò)光譜研究發(fā)現(xiàn)該探針能高效率地選擇性識(shí)別谷胱甘肽與其他含硫氨基酸。在生理緩沖體系，其檢測(cè)限達(dá)到2.4 M。此外，該探針在活性細(xì)胞中成功測(cè)試谷胱甘肽，探針選擇性響應(yīng)谷胱甘肽的機(jī)制通過(guò)HPLC-M

6、S和DFT計(jì)算得以驗(yàn)證，本文所發(fā)現(xiàn)的谷胱甘肽識(shí)別機(jī)制是一種未見文獻(xiàn)報(bào)道的新型作用機(jī)制，有望在設(shè)計(jì)新型GSH選擇性熒光探針中得到應(yīng)用。
　　為開發(fā)新型熒光母核，本文合成了七個(gè)基于萘酰亞胺母核的新型染料，該系列化合物受取代基的電子效應(yīng)影響，顏色變化較大，在二氯甲烷中顯示較強(qiáng)熒光，其中Probe7f對(duì)pH有敏感的響應(yīng)性，紫外光譜與熒光光譜實(shí)驗(yàn)表明它是一種比率型pH探針特性。通過(guò)核磁滴定與DFT計(jì)算研究，闡述了該探針的作用機(jī)制，為進(jìn)一步開