合成新型熒光探針用于活細(xì)胞內(nèi)雙(多)巰基蛋白的檢測及成像分析.pdf

1、生物體內(nèi)還原性物質(zhì)在維持和調(diào)節(jié)生物體的氧化還原內(nèi)環(huán)境起著重要的作用.許多研究表明還原性物質(zhì)對于機(jī)體具有抗氧化防御作用,而且還具有其他一些生理功能,如解毒、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老及抗癌.由于還原性物質(zhì)具有氧化還原調(diào)控的重要作用,因此就必須設(shè)計出一些適用于細(xì)胞內(nèi)還原物種的高選擇性、高靈敏度檢測的小分子熒光探針,用于細(xì)胞內(nèi)還原物種的識別、定量.
　　蛋白質(zhì)是生物體最重要的組成成分之一,是生命活動的重要參與者.蛋白質(zhì)種類極其繁多,分布極其廣

2、泛,所具有的功能也各不相同.生物體內(nèi)的很多生理和病理現(xiàn)象都與蛋白質(zhì)的病變有關(guān),如亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默病、帕金森病以及癌癥等.要有效治療上述任何一種疾病,最主要的途徑是研發(fā)新的治療藥物,而其中很多都是以蛋白質(zhì)為靶點(diǎn).因此,蛋白質(zhì)的研究對于生物醫(yī)學(xué)研究及疾病治療有著重要的意義.
　　蛋白質(zhì)中的巰基很容易被活性氧、活性氮氧化,其對于維持蛋白質(zhì)的氧化還原環(huán)境起著重要的作用.如調(diào)節(jié)信號通路,對不同疾病如癌癥、糖尿病及神經(jīng)退行性疾病的響應(yīng)

3、情況.蛋白質(zhì)中的巰基主要是指半胱氨酸殘基中的巰基,是所有氨基酸殘基中最活潑的基團(tuán).巰基在蛋白質(zhì)中具有重要的作用,如具有一定的抗氧化作用,能保護(hù)細(xì)胞,防止被氧化.當(dāng)巰基所處的氧化還原環(huán)境變化時,巰基和二硫鍵之間會發(fā)生轉(zhuǎn)換.所以,對活細(xì)胞內(nèi)雙(多)巰基蛋白檢測具有重要的生物學(xué)及醫(yī)學(xué)意義.蛋白熒光分析法由于具有選擇性好、靈敏度高、反應(yīng)時間短、實時成像等優(yōu)點(diǎn),在生命科學(xué)及分析化學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景.
　　目前,用于檢測生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的

4、熒光小分子探針種類繁多,但是它們都是借助于基因融合技術(shù)間接檢測,而直接檢測生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的熒光探針還鮮有報道.因此我們設(shè)計了一種新型小分子熒光探針用于生物體內(nèi)雙(多)巰基蛋白的直接檢測,應(yīng)用激光共聚焦成像技術(shù),對其進(jìn)行實時原位檢測.本論文是基于熒光探針與巰基類物質(zhì)特異性結(jié)合后熒光光譜性質(zhì)發(fā)生變化,來實現(xiàn)對其的檢測.本論文主要開展了以下兩方面的工作.
　　(一)以吖啶衍生物為母體,以N取代馬來酰亞胺為識別基團(tuán),設(shè)計合成了含有兩個馬來

5、酰亞胺基團(tuán)的熒光探針 O-Dm-Ac和熒光探針 M-Dm-Ac,可以對谷胱甘肽 GSH及含有雙巰基的小肽進(jìn)行快速檢測.兩探針本身熒光背景較弱,當(dāng)與 GSH發(fā)生反應(yīng)后,熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),且熒光探針 O-Dm-Ac熒光強(qiáng)度變化更明顯,兩熒光探針激發(fā)和發(fā)射波長均分別位于360 nm和460 nm.以熒光探針 O-Dm-Ac為研究對象,在模擬生理條件下,研究了含有兩個巰基的小肽序列 W-6肽、W-7肽及W-8肽與其響應(yīng)情況,可以看出7肽響應(yīng)更好

6、,這是因為7肽兩個巰基之間的距離與熒光探針 O-Dm-Ac上兩個馬來酰亞胺之間的距離匹配性更好,熒光強(qiáng)度變化更大.在0到5.5μM范圍內(nèi),W-7肽的濃度與熒光強(qiáng)度有良好的線性關(guān)系,而且探針 O-Dm-Ac不受金屬離子及其他活性小分子的干擾.
　　(二)在前面研究的基礎(chǔ)上,我們知道當(dāng)兩個馬來酰亞胺之間的距離與含有雙巰基的小肽兩個巰基之間的距離匹配時,熒光探針 O-Dm-Ac可以識別含有雙巰基的小肽.生物體內(nèi)內(nèi)源性的多巰基蛋白對于氧化

7、還原平衡起著關(guān)鍵的作用.生物體內(nèi)的巰基蛋白一般含有多個巰基,對周圍氧化還原環(huán)境的變化很敏感,很容易被氧化.當(dāng)有氧化物質(zhì)存在時,兩個相鄰的巰基會迅速轉(zhuǎn)化成二硫鍵.由于相鄰巰基蛋白的重要功能,對生物系統(tǒng)蛋白質(zhì)組中相鄰巰基蛋白的直接檢測具有重要意義.我們研究了熒光探針 O-Dm-Ac與含有多巰基的還原型蛋白牛血清白蛋白的響應(yīng)情況,發(fā)現(xiàn)探針能夠有效的檢測該蛋白.在0到1.75μM濃度范圍內(nèi)還原型牛血清白蛋白的濃度與熒光強(qiáng)度有良好的線性關(guān)系.此外