重組NDVHN基因減毒雞白痢沙門(mén)菌的構(gòu)建及其特性研究.pdf

1、新城疫是由新城疫病毒引發(fā)的一種急性和高度接觸性禽類疾病，對(duì)世界養(yǎng)禽業(yè)造成了毀滅性的破壞，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列入必須進(jìn)行通報(bào)的動(dòng)物疾病之一。近年來(lái)，由于傳統(tǒng)疫苗對(duì)新城疫預(yù)防的種種缺陷，研制一種新型基因工程疫苗來(lái)預(yù)防和控制新城疫勢(shì)在必行。雞白痢沙門(mén)菌（S. Pullorum）是目前危害養(yǎng)雞業(yè)的重要細(xì)菌之一，藥物控制該菌易造成生物安全問(wèn)題，傳統(tǒng)疫苗免疫力不高，因此，將減毒沙門(mén)菌作為預(yù)防細(xì)菌疾病的新型活疫苗是當(dāng)下控制雞白痢的首選途徑。本試驗(yàn)在

2、減毒S. Pullorum C79-13Δcrp的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步缺失asd基因，利用其質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)構(gòu)建重組菌株C79-13ΔcrpΔasd(pYA-HN)，并對(duì)其生物學(xué)及免疫學(xué)特性進(jìn)行研究。
　　1.減毒S. Pullorum C79-13ΔcrpΔasd株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性
　　本研究以S. Pullorum C79-13Δcrp作為受體菌、大腸桿菌χ7213(pREΔasd)作為供體菌，將二者進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，并通過(guò)“

3、兩步法”篩選asd基因缺失株，PCR鑒定結(jié)果及測(cè)序結(jié)果顯示，成功構(gòu)建S. Pullorum缺失株C79-13ΔcrpΔasd。生物學(xué)特性結(jié)果表明，該菌在DAP陰性環(huán)境中存活的能力喪失，同時(shí)也失去了利用麥芽糖、葡萄糖、甘露醇和鼠李糖等碳源的能力；其血清型與野生株C79-13一致，生長(zhǎng)速度減慢；能夠在體外穩(wěn)定遺傳asd缺失基因；雛雞口服攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示重組菌株LD50較野生株C79-13升高約3.1×104倍。
　　2.重組NDV H

4、N減毒S.Pullorum的構(gòu)建及其生物學(xué)特性
　　本試驗(yàn)將PCR擴(kuò)增出的HN基因片段克隆至無(wú)抗性原核表達(dá)載體pYA3493，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pYA-HN，進(jìn)而將經(jīng)PCR及酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒導(dǎo)入C79-13ΔcrpΔasd中構(gòu)建重組菌株C79-13ΔcrpΔasd(pYA-HN)。該重組菌株的生化特性與生長(zhǎng)特性與C79-13ΔcrpΔasd基本保持一致；NDV HN基因能夠在體外穩(wěn)定遺傳；SDS-PAGE結(jié)果顯示HN基因在重組

5、菌中得到了表達(dá)，Western blot結(jié)果表明表達(dá)蛋白具有良好的免疫原性；重組菌毒力較野生株C79-13升高約3.4×104倍；定植試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組菌對(duì)雞體具有較好的侵襲力。
　　3.重組菌株C79-13ΔcrpΔasd(pYA-HN)的免疫學(xué)特性研究
　　重組菌株口服免疫雛雞，對(duì)其免疫學(xué)特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，對(duì)雞只體重的增加與對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05），能顯著刺激雞體免疫器官指數(shù)的增加（P<0.05）；血清

6、HI抗體測(cè)定結(jié)果顯示，HI抗體水平于免疫后21d時(shí)達(dá)到最大值（log2=5.3）；重組菌免疫后第21d免疫血清中沙門(mén)菌 IgG抗體水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；在重組菌株免疫雞腸道沖洗液中檢測(cè)到較 PBS組高水平的分泌型IgA(log2=3.56)；免疫組所分離的淋巴細(xì)胞經(jīng)體外刺激后其SI在免疫第21d達(dá)到最大值，即1.698，與 PBS組相比差異顯著（P<0.05）；免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組菌免疫組可能100％抵抗沙門(mén)菌野生株