NDV HN基因重組減毒雞白痢沙門菌的構(gòu)建及其免疫效力檢測.pdf

1、新城疫(Newcastle disease)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的禽類的一種急性高度接觸性傳染病，對全球養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。HN蛋白作為 NDV的重要宿主保護(hù)性抗原已成為人們研究 ND疫苗的首選抗原。減毒沙門菌的主要優(yōu)點(diǎn)包括它可以經(jīng)黏膜途徑免疫(口服或鼻內(nèi))，操作方便，對接種宿主刺激小，免疫力堅(jiān)實(shí)，免疫期長，并且可作為疫苗載體運(yùn)送外來抗原，誘導(dǎo)出針對該外源基因的特異性免疫反應(yīng)

2、。此外，利用基因工程的方法構(gòu)建的減毒沙門菌疫苗安全性好、不易返祖。因此本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了能夠表達(dá) NDV HN的減毒雞白痢沙門菌ΔcrpC79-13(pcDNA3.0-HN)并對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，評估該重組菌的口服免疫效果及對新城疫Ⅳ系疫苗的免疫增強(qiáng)作用。
　　1.重組NDV HN減毒S.Pullorum的構(gòu)建及其生物學(xué)特性
　　本研究以pMD18-HN為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出HN基因后定向插入真核表達(dá)載體pcDNA3.0中，構(gòu)

3、建重組質(zhì)粒pcDNA3.0-HN，再通過電轉(zhuǎn)化的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入雞白痢沙門菌ΔcrpC79-13中，構(gòu)建重組減毒雞白痢沙門菌ΔcrpC79-13(pcDNA3.0-HN)，并進(jìn)一步研究其生物學(xué)特性及侵染Vero細(xì)胞后HN蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。PCR和酶切結(jié)果顯示重組菌ΔcrpC79-13(pcDNA3.0-HN)構(gòu)建成功；生物學(xué)特性結(jié)果顯示，重組菌與親本株ΔcrpC79-13相似，均失去了利用麥芽糖、丙三醇和山梨醇及分解H2S等的能

4、力，生長速度均低于野生株C79-13，且可穩(wěn)定遺傳HN基因；間接熒光免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在重組菌侵染Vero細(xì)胞后48 h可檢測到HN蛋白特異性熒光。雛雞口服攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明重組菌ΔcrpC79-13(pcDNA3.0-HN)的半數(shù)致死量約為野生株C79-13的4.2×104倍。以上結(jié)果表明，成功構(gòu)建了表達(dá)NDV HN蛋白的口服重組減毒雞白痢沙門菌。
　　2.重組菌株ΔcrpC79-13(pcDNA3.0-HN)的免疫學(xué)特性研究

5、r>　　為研究重組減毒雞白痢沙門氏菌的口服免疫原性。將重組菌株ΔcrpC79-13(pcDNA3.0-HN)及對照組ΔcrpC79-13(pcDNA3.0)以1×109 CFU/只口服免疫7日齡雛雞。結(jié)果顯示：雞只體重的增加與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，能顯著刺激雞體免疫器官指數(shù)的增加(P<0.05)；在免疫后14～35 d，可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗NDV的HI抗體，且在免疫后21 d時(shí)達(dá)到最高值；可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗雞白痢沙門菌的IgG抗體，且

6、在免疫后28d達(dá)到最高值；在21-35 d，ΔcrpC79-13(pcDNA3.0-HN)組腸道黏膜IgA抗體含量極顯著高于ΔcrpC79-13(pcDNA3.0)組(P<0.01)。在免疫后28 d，ΔcrpC79-13(pcDNA3.0-HN)組外周血淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)達(dá)到峰值1.725，顯著高于ΔcrpC79-13(pcDNA3.0)組(P<0.05)。用103EID50NDV F48E9株攻毒，保護(hù)率達(dá)67％(10/15)，用10

7、9CFU雞白痢沙門菌C79-13攻毒，保護(hù)率為100%。結(jié)果表明重組減毒雞白痢沙門菌ΔcrpC79-13(pcDNA3.0-HN)疫苗菌株具有良好的口服免疫原性。
　　3.重組菌對新城疫Ⅳ疫苗的免疫增強(qiáng)作用
　　為探討重組減毒雞白痢沙門菌對新城疫Ⅳ疫苗的免疫增強(qiáng)作用。結(jié)果顯示，聯(lián)合疫苗免疫組可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的 HI抗體、IgG抗體和腸道黏膜 IgA抗體，與重組菌組和NDVⅣ疫苗組相比均差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0