雞白痢沙門菌S06004△spiC突變株的構(gòu)建及其免疫生物學(xué)特性初步研究.pdf

1、目前，雞白痢沙門菌仍是我國養(yǎng)雞業(yè)中危害嚴(yán)重的細(xì)菌之一，能造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)常采用藥物控制該菌，但同時(shí)造成了細(xì)菌耐藥性和藥物殘留等問題。此外，在實(shí)際生產(chǎn)中沒有實(shí)施嚴(yán)格的檢疫淘汰措施，使得雞群中的雞白痢陽性率仍較高。盡管許多國家逐漸使用活疫苗預(yù)防來控制沙門菌病，取得了很好的效果，但是由于雞白痢沙門菌在發(fā)達(dá)國家基本消滅且不感染人，有關(guān)它的疫苗研究報(bào)道較少，而已有的滅活疫苗的保護(hù)水平往往較低而不能產(chǎn)生堅(jiān)實(shí)的免疫力。
　　 近年來，

2、利用基因工程技術(shù)將強(qiáng)毒株毒力相關(guān)基因敲除構(gòu)建新型減毒沙門菌作為疫苗的研究備受關(guān)注，新型減毒活疫苗安全性好、不易返祖;在減毒的同時(shí)不喪失免疫原性，活疫苗可在免疫動(dòng)物體內(nèi)繁殖，能刺激機(jī)體產(chǎn)生全身免疫反應(yīng)和局部免疫反應(yīng)，并對(duì)病原體的多種抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答;免疫力堅(jiān)實(shí)，免疫期長(zhǎng)，也可作為疫苗載體運(yùn)送外來抗原，比滅活疫苗和亞單位疫苗在預(yù)防控制沙門菌的感染方面更有優(yōu)勢(shì)，因而是較為理想的疫苗。
　　 本研究通過自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)同源重組的方法構(gòu)建了

3、雞白痢沙門菌毒力相關(guān)基因spiC缺失株，并評(píng)價(jià)了其生物學(xué)特性，初步探索了雞白痢沙門菌S06004△spiC突變株作為減毒活疫苗的可行性。
　　 1雞白痢沙門菌S06004△spiC突變株的構(gòu)建與鑒定
　　 為構(gòu)建雞白痢沙門菌S06004△spiC突變株，以細(xì)菌S06004基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增:spiC基因上游797bpDNA序列，spiC基因下游497bpDNA序列。將上游片段、Km抗性基因片段及下游片段成功連接后

4、，克隆到pGMB151自殺性質(zhì)粒上，借助E.coli.x7213感受態(tài)細(xì)胞，與野生株S06004接合轉(zhuǎn)移，進(jìn)行同源重組，兩步法篩選含Km抗性基因的△spiC突變株。對(duì)篩選得到的陽性克隆，再電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入編碼FLP重組酶的溫度敏感型質(zhì)粒pCP20，去除Km抗性基因，結(jié)合PCR和測(cè)序結(jié)果，證明spiC基因缺失株S06004△spiC成功構(gòu)建。進(jìn)一步鑒定雞白痢沙門菌S06004△spiC突變株的表型、生長(zhǎng)特性、毒力等，結(jié)果表明該突變株生化鑒定與生

5、長(zhǎng)特性與野生株比較無顯著差異，spiC基因缺失后，肌注接種3日齡海蘭白雛雞，其LD50約為1.12×109CFU，與S06004野生株LD50(約為7.27×106CFU)比，升高了約1.54×102倍，毒力顯著降低。為后期研究其作為減毒雞白痢沙門菌活疫苗的可能性奠定了重要基礎(chǔ)。
　　 2減毒雞白痢沙門菌S06004△spiC突變株的免疫生物學(xué)特性初步研究
　　 為研究雞白痢沙門菌S06004△spiC減毒突變株的生物學(xué)

6、特性，體外實(shí)驗(yàn)選取禽巨噬細(xì)胞系HD-11為模型，顯示S06004△spiC突變株與野生株S06004相比，侵入巨噬細(xì)胞及在胞內(nèi)增殖的增殖能力明顯下降;將S06004△spiC突變株以口服和肌肉注射兩種途徑免疫3日齡雛雞后，口服S06004△spiC突變株組在肝臟第7天被清除，在脾臟于第9-11天細(xì)菌被清除;肌注組在免疫后3-4周，細(xì)菌在體內(nèi)被清除，其清除速度顯著快于口服野生菌組。
　　 免疫保護(hù)效力實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)3日齡雛雞免疫后第

7、10天，雞白痢沙門菌野生株攻毒有良好的保護(hù)率，對(duì)相近血清型的雞傷寒沙門菌的攻毒也有一定的保護(hù)作用。增重實(shí)驗(yàn)顯示，利用突變株免疫后雞的增重與空白組比無顯著差異。利用間接ELISA檢測(cè)血清中IgG抗體，顯示減毒雞自痢沙門菌免疫后第1周可以檢測(cè)到IgG抗體第3周抗體IgG達(dá)到高峰水平;免疫后第2周開始可以檢測(cè)到黏膜抗體IgA，在第3-4周達(dá)到較高水平。最后利用熒光定量PCR檢測(cè)在感染過程中相關(guān)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)量變化，結(jié)果顯示炎性因子IL