雞白痢沙門菌△fur△speDE的構(gòu)建及其免疫生物學(xué)特性初步研究.pdf

1、雞白痢沙門菌（Salmonella enterica serovar Pullorum）是一類禽致病性革蘭陰性桿菌。雛雞感染后表現(xiàn)為急性敗血癥，以拉白色粥樣或黏性糞便為特征，呈現(xiàn)高發(fā)病率和高死亡率。成年雞感染后表現(xiàn)為隱性帶菌或慢性經(jīng)過(guò)，不造成死亡。雞白痢沙門菌不僅能夠水平傳播，還可以經(jīng)蛋垂直傳播，導(dǎo)致了雞蛋孵化率的降低和雛雞死亡率的升高。在許多發(fā)展中國(guó)家，雞白痢沙門菌仍是家禽養(yǎng)殖業(yè)中危害嚴(yán)重的細(xì)菌之一，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為控制雞白痢

2、，國(guó)內(nèi)外采取了一系列措施，包括疫苗免疫、抗生素治療、檢疫淘汰和生物安全措施等。多年實(shí)踐表明，在特定情況下，疫苗接種是防控雞群雞白痢的最有效措施之一。用于防控沙門菌的疫苗主要分為滅活疫苗、亞單位疫苗和減毒活疫苗三種，而減毒活疫苗以其安全性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、在減毒的同時(shí)不喪失免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是較為理想的疫苗。
　　良好的減毒活疫苗必須保持細(xì)菌毒力和免疫保護(hù)效力之間的平衡，因此，利用基因工程構(gòu)建減毒活疫苗的關(guān)鍵在于靶基因的選擇。本文選

3、擇fur和speDE基因作為減毒靶基因，利用λ-red同源重組系統(tǒng)，構(gòu)建了雞白痢沙門菌S06004△fur△spe DE基因缺失株，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，初步探討了該基因缺失株作為減毒活疫苗的可行性。
　　1雞白痢沙門菌fur△peDE基因缺失株的構(gòu)建及其LD50測(cè)定
　　本研究成功構(gòu)建了雞白痢沙門菌S06004△fur△spe DE基因缺失株。PCR鑒定和測(cè)序結(jié)果表明，fur和speDE基因敲除成功。與野生株相比，S

4、06004 fur△speDE的部分生物化學(xué)特性發(fā)生了改變，且S06004△fur△speDE的生長(zhǎng)速度慢于野生株的生長(zhǎng)速度。通過(guò)遺傳穩(wěn)定性分析，S06004△fur△speDE連續(xù)傳至50代后，缺失的基因不能夠再回復(fù)。以海蘭白品系雛雞為動(dòng)物模型，對(duì)S06004△fur△speDE進(jìn)行毒力評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，與野生株相比，S06004△fur△spe DE的LD50提高了約105倍，而S06004△fur口S06004△spe DE的LD5

5、0僅分別提高了約73.4倍和4.95倍。這些結(jié)果說(shuō)明speDE和fur基因的缺失造成了雞白痢沙門菌S06004毒力的下降，S06004△fur△speDE具有良好的安全性，可作為減毒活疫苗候選株進(jìn)行后續(xù)研究。
　　2減毒雞白痢沙門菌△fur△speDE免疫生物學(xué)特性初步研究
　　本研究通過(guò)細(xì)胞和雛雞模型初步評(píng)價(jià)了S06004△fur△speDE的免疫生物學(xué)特性。以S06004△fur△speDE和野生株分別感染禽巨噬細(xì)胞HD

6、-11后發(fā)現(xiàn)，S06004△fur△speDE對(duì)細(xì)胞的黏附能力與野生株相比無(wú)顯著差別，但侵襲細(xì)胞及在細(xì)胞內(nèi)增殖的能力顯著降低(P＜0.05)。基因缺失株在機(jī)體內(nèi)消減動(dòng)態(tài)的分析及其免疫保護(hù)效力的評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，S06004△fur△speDE以口服和肌肉注射2種途徑分別免疫3日齡雛雞后，在口服組中，免疫10天后S06004△fur△speDE在肝臟和脾臟中被清除，而肌注組在免疫21天后，S06004△fur△speDE在肝臟和脾臟中被清除。

7、S06004△fur△speDE以口服和肌注2種方式分別免疫3日齡雛雞2周后，再分別以口服和肌注方式攻毒，結(jié)果顯示，S06004△fur△spe DE以2種方式免疫2周后，能夠?qū)σ吧ザ咎峁?00％免疫保護(hù)，其體重凈增量也比未免疫組有所提高;肝臟和脾臟病理切片顯示，組織病變程度明顯輕于未免疫組。間接ELISA檢測(cè)血清中IgG抗體和黏膜IgA抗體的產(chǎn)生水平，結(jié)果顯示S06004△fur△speDE能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的IgG抗體和Ig