豬支氣管敗血波氏桿菌皮膚壞死毒素基因的原核表達(dá)及間接ELISA檢測(cè)方法的初步建立.pdf

1、由支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)引起的非進(jìn)行性豬萎縮性鼻炎被認(rèn)為是一種重要的上呼吸道疾病。該病可導(dǎo)致育肥豬生長(zhǎng)遲滯，降低飼料的利用率，給世界畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其主要的臨床癥狀為：鼻炎、鼻甲骨萎縮和顏面變形等。
　　 據(jù)報(bào)道，Bb和其菌相有致病性關(guān)系，其中強(qiáng)皮膚壞死毒素(dermonecrotic toxin，DNT)在I相菌中的毒力是最強(qiáng)的，具有不耐熱的短鞭毛和莢膜，毒力比

2、其他相菌的都強(qiáng)。該毒素是一種很主要的致病因子，由DNT基因編碼，在這個(gè)菌的致病過(guò)程中起著非常重要的作用。
　　 本研究針對(duì)Bb的DNT基因及其表達(dá)的產(chǎn)物開展了以下的工作：
　　 參照GenBank上已經(jīng)發(fā)表的DNT基因序列，設(shè)計(jì)了三對(duì)引物，以本實(shí)驗(yàn)室分離并保存的Bb菌株為實(shí)驗(yàn)材料，用PCR等方法分三段克隆了Bb的DNT基因，再連接成與目的相符的全毒素基因。接著對(duì)全毒素基因序列進(jìn)行測(cè)定。還選擇PET高效原核表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建了

3、重組表達(dá)質(zhì)粒PET-DNT。結(jié)果顯示：目的基因有4395 bp左右，同GenBank上的其中的3個(gè)DNT基因序列相比，如下：U59687、E17214、AB020025相比，核苷酸的同源性達(dá)到99.2％以上。表明該基因不存在地域性的差別。同時(shí)表明dnt全毒素基因是十分保守的。
　　 接著將分段擴(kuò)增的產(chǎn)物插入原核表達(dá)載體PET-28a中，成功構(gòu)建了三個(gè)重組質(zhì)?！癙ET-DNTN、PET-DNTu、PET-DNTc"。并通過(guò)PCR及

4、酶切鑒定等方法，均能得到基本與理論相符合的基因片段，表明這三個(gè)原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。研究二，將重組質(zhì)粒“PET-DNTN”轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)獲得大小約33 kDa的表達(dá)蛋白(rDNTN)。
　　 以DNT基因5’端亞克隆表達(dá)產(chǎn)物rDNTN為抗原，初步建立一種間接ELISA方法，目的是檢測(cè)DNT抗體。用多次方陣滴定的方法來(lái)確定抗原的最佳包被濃度，最后確定為1.6 ug/ml、關(guān)于血清的最佳稀釋倍數(shù)也

5、用相同方法，為1:100，陰陽(yáng)分界為OD630=0.313;該方法初步檢測(cè)了266份臨床送檢樣品，結(jié)果表明陽(yáng)性率達(dá)到31.2％．
　　 為了能更好的研究毒素蛋白的一些生物學(xué)活性，通過(guò)健康豚鼠的皮膚壞死試驗(yàn)來(lái)研究表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性。結(jié)果顯示：表達(dá)產(chǎn)物和天然毒素相比較，DNT的皮膚壞死活性前者較低。Westem blot的結(jié)果則表明表達(dá)產(chǎn)物反應(yīng)原性是良好的。
　　 本研究成功地克隆并表達(dá)了Bb菌株毒素DNT4395 bp基