豬支氣管敗血波氏桿菌（Bb）的分離鑒定與血清抗體檢測(cè).pdf

1、支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabronchiseptica,Bb)是一類(lèi)定植在動(dòng)物呼吸道黏膜纖毛上皮細(xì)胞上的革蘭氏陰性、需氧球桿菌，是引起豬萎縮性鼻炎(AtrophicrhinitisofSwine,AR)的重要病原菌，單獨(dú)感染可引起豬的非進(jìn)行性萎縮性鼻炎(Non-progressingatrophicrhinitis,NPAR)，若與產(chǎn)毒素性多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm)混合感染則可引起豬的

2、進(jìn)行性萎縮性鼻炎(Progressiveatrophicrhinitis,PAR)。AR是一種慢性接觸性呼吸道傳染病，其主要特征是鼻塞、打噴嚏、流鼻血、咳嗽、呼吸不暢、顏面變形或鼻梁歪斜等，屬于世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)的B類(lèi)重大傳染病，亦被我國(guó)列為二類(lèi)動(dòng)物疫病，是進(jìn)出口動(dòng)物衛(wèi)生檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中的必檢項(xiàng)目。本研究通過(guò)采集貴州省11個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)的豬鼻腔棉拭子進(jìn)行了Bb的分離與鑒定；通過(guò)BbI相菌的篩選與鑒定，制備Bb凝集診斷抗原，對(duì)24個(gè)不同養(yǎng)豬群

3、進(jìn)行Bb血清抗體的檢測(cè)；通過(guò)疫苗接種和藥物治療對(duì)AR污染種豬場(chǎng)A進(jìn)行了控制與凈化研究。具體內(nèi)容包括： 1、貴州省豬群Bb的分離與鑒定：采集11個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)156頭份鼻腔棉拭子進(jìn)行Bb的分離，通過(guò)培養(yǎng)特性與生化特征的鑒定，結(jié)果細(xì)菌分離物在葡萄糖改良麥康凱中呈茶色或茶黃色菌落，在TSA上呈奶油狀菌落；染色鏡檢為革蘭氏陰性、無(wú)芽胞的球桿菌，硝酸銀染色可見(jiàn)周毛菌；經(jīng)生化鑒定，符合Bb生化特點(diǎn)的分離物共計(jì)34株，分離率為21.8％(34/15

4、6)。針對(duì)BbFlaA基因上游序列選擇合成一對(duì)特異性引物(Fla1/Fla2)，對(duì)34株Bb分離物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果所有分離物均能擴(kuò)增出約240bp特異性DNA條帶，與傳統(tǒng)的生化反應(yīng)鑒定完全一致，且最小檢出量為0.64Pg；而豬鼻腔和肺組織中常見(jiàn)的其它細(xì)菌均顯現(xiàn)陰性反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析，結(jié)果酶切產(chǎn)物與DNAStar軟件分析結(jié)果相符合；克隆后測(cè)序，結(jié)果該基因片段全長(zhǎng)為237bp，與預(yù)期大小和序列一致；應(yīng)用該P(yáng)CR方法對(duì)27份豬

5、鼻腔棉拭子進(jìn)行臨床檢測(cè)，結(jié)果Bb檢出率為25.9％(7/27)，檢出率較傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)方法高。 2、貴州省豬群Bb血清抗體的檢測(cè)：首先采用結(jié)晶紫染色法(CV)對(duì)貴州省Bb分離物進(jìn)行I相菌篩選后，再行細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)、培養(yǎng)特性和外膜蛋白分子量鑒定，結(jié)果CV+菌為深紫色菌落，節(jié)思明染色可見(jiàn)無(wú)色透明莢膜，在血平板上呈β溶血，經(jīng)SDS-PAGE電泳可見(jiàn)74kD蛋白帶，即為BbI相菌，而CV-菌為無(wú)色菌落、節(jié)思明染色未見(jiàn)莢膜、在血平板上呈γ溶

6、血，經(jīng)SDS-PAGE電泳無(wú)74kD蛋白帶，即為Bb菌相變異菌。利用I相菌制備Bb凝集診斷抗原，并確定凝集診斷抗原的最佳反應(yīng)條件后，用于貴州省24個(gè)不同養(yǎng)豬群1077份血清樣本的Bb血清抗體檢測(cè)，結(jié)果在3個(gè)表現(xiàn)AR臨床癥狀的豬群中，Bb血清抗體的陽(yáng)性率61.36％(54/88)：在12個(gè)未表現(xiàn)AR臨床癥狀的中豬群，Bb血清抗體的陽(yáng)性率為6.71％(37/552)；在9個(gè)屠宰場(chǎng)的豬群中，Bb血清抗體的陽(yáng)性率為8.92％(39/437)，表

7、明Bb血清抗體的陽(yáng)性率與AR臨床癥狀出現(xiàn)具有相關(guān)性，且我省部分養(yǎng)豬場(chǎng)存在Bb隱性感染狀態(tài)，應(yīng)加以重視。 3、AR污染種豬場(chǎng)的控制與凈化研究：在病原學(xué)檢查和血清學(xué)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，種豬場(chǎng)A為AR感染較為嚴(yán)重的豬場(chǎng)之一。本研究采取疫苗接種和藥物防治，結(jié)合淘汰病豬和加強(qiáng)飼養(yǎng)管理等綜合措施，在項(xiàng)目實(shí)施期間，共淘汰臨床發(fā)病母豬(包括后備母豬)50頭，淘汰率為8.1％(50/620)；隱性帶菌豬經(jīng)藥物治療后快速育肥出售800頭；其余臨床健康豬只(