豬支氣管敗血波氏桿菌分離鑒定及疫苗菌株的生物學特性研究.pdf

1、支氣管敗血波氏桿菌（Bordetella bronch&eptica，Bb）是一種重要的病原菌，廣泛感染包括豬、犬等家畜，兔、豚鼠等實驗動物，雪貂、考拉熊及栗鼠等野生動物在內(nèi)的多種哺乳動物，并造成急慢性的呼吸道疾病。人也有感染該菌的報道，尤其是小孩和免疫力缺陷的人群。此外，支氣管敗血波氏桿菌和其他病原體之間具有協(xié)同作用，這樣的作用可提高呼吸道疾病的發(fā)病率并增加其發(fā)病的嚴重程度。 Bb的致病性與其菌相有關，Ⅰ相菌有不耐熱的莢膜和短

2、鞭毛，具有強皮膚壞死毒素（dermonecrotlc toxin，DNT），比Ⅱ相菌和Ⅲ相菌的毒力都強。該毒素由dnt基因編碼，是一種主要致病因子，在細菌的致病過程中起著重要作用。雖然是外毒素，但存在于胞漿內(nèi)，只有當細菌裂解后才會釋放出來發(fā)揮活性。 本研究針對Bb及DNT主要開展了以下工作： 1、應用豬支氣管敗血波氏桿菌的PCR檢測方法，結(jié)合細菌的鏡檢和生化試驗，從臨床樣品中分離鑒定到31株Bb，并且都是Ⅰ相菌。其中30

3、株分離于肺臟，1株分離于鼻拭子樣品。對每一分離菌株進行了藥敏實驗，同時進行血凝試驗和乳鼠皮膚壞死試驗。 2、參照GenBank已發(fā)表的dnt基因序列，設計了三對引物，通過PCR分段克隆了Bb的dnt基因，再利用片端自身的酶切位點連接成完整的全毒素基因。以pET-28a為載體，構(gòu)建了表達質(zhì)粒pET-dnt并進行了序列測定。結(jié)果表明：該基因共4395bp，與GenBank上所報道的3個dnt基因序列U59687、AB020025、E

4、17214相比，核苷酸同源性都在99.6％以上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL<,21>，實現(xiàn)了dnt全基因的高效表達。表達蛋白rDNT約140kDa，通過乳鼠皮膚壞死試驗證明表達蛋白具有一定的生物活性。 3、通過對比目前常用的液體培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)加有血清的胰蛋白酶大豆肉湯（TSB+S）最有利于Bb的培養(yǎng)。利用濁度測定和細菌計數(shù)對Bb在TSB+S中的生長周期進行測定，發(fā)現(xiàn)其在8h～32h進入對數(shù)生長期，而后進入穩(wěn)定期。而且，Bb在對數(shù)生長期中細菌

5、濁度和活菌量間具有對應關系。 4、以小鼠為實驗動物模型，對4株菌株ZK1217、JS3928、QH0814和HH0809，進行毒力比較。證明菌株具有脾萎縮毒性，并篩選出毒力最強的菌株是鼻拭子分離菌HH0809，其LD<,50>為4.4×10<'5>CFU/mL，可以作為滅活苗的疫苗菌株。并證明了此菌株在液體培養(yǎng)基中5代內(nèi)具有良好的傳代穩(wěn)定性。 5、疫苗菌株HH0809仔豬感染試驗證明氣管注射比滴鼻接種的方式能更快更好地復