支氣管敗血波氏桿菌△hfq突變株的構(gòu)建及生物學(xué)特性分析.pdf

1、支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)，革蘭氏陰性、需氧的球桿菌，感染可引發(fā)犬傳染性氣管支氣管炎和兔波氏桿菌病，也是引起豬傳染性萎縮性鼻炎的重要致病因子之一。Hfq參與調(diào)節(jié)細(xì)菌的多種生命活動，綠膿桿菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、布氏桿菌、霍亂弧菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，腦膜炎奈瑟菌等hfq缺失后，細(xì)菌對小鼠的毒力明顯減弱，對細(xì)胞的侵襲能力降低;同時針對其構(gòu)建突變株，可獲得減毒新型疫苗株。Hfq對

2、支氣管敗血波氏桿菌的調(diào)節(jié)作用尚不清楚。因此，進(jìn)行支氣管敗血波氏桿菌⊿hfq突變株研究，明確Hfq的調(diào)節(jié)作用，可揭示支氣管敗血波氏桿菌的致病機(jī)制，也可為研究其減毒新型疫苗提供可能性。
　　采用正向篩選同源重組技術(shù)，PCR擴(kuò)增Bb122株hfq兩端側(cè)翼序列，將其克隆至質(zhì)粒pBC-SK相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建自殺性質(zhì)粒pBC-hfq;克隆卡那霉素抗性基因表達(dá)盒至hfq兩端側(cè)翼序列之間，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBC-⊿hfq。將pBC-⊿hfq電轉(zhuǎn)

3、化至Bb122感受態(tài)細(xì)胞中。在抗性培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，通過對卡那霉素抗性基因表達(dá)盒進(jìn)行PCR和測序驗(yàn)證、對缺失的hfq進(jìn)行PCR驗(yàn)證，表明卡那霉素抗性基因表達(dá)盒已經(jīng)插入至hfq兩端側(cè)翼序列之間，hfq已經(jīng)缺失完全，證明成功構(gòu)建了支氣管敗血波氏桿菌⊿hfq突變株。連續(xù)傳20代，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。體外生長曲線表明:在37℃培養(yǎng)時，⊿hfq突變株在1～6h生長速度基本和親本菌株Bb122一致，6h后生長速度略快于親本菌株。進(jìn)行抗逆性試驗(yàn)，在

4、紫外線照射(UV)和50℃條件下，⊿hfq白突變株的耐受能力分別顯著低于親本菌株(p＜0.05);在H2O2條件下，⊿hfq突變株與親本菌株均無耐受能力。粘附和侵襲試驗(yàn)表明⊿hfq突變株的粘附、侵襲能力低于親本菌株，差異不顯著。⊿hfq突變株與親本菌株分別對小鼠進(jìn)行腹腔接種，⊿hfq突變株以2.0×109cfu劑量接種時，5只小鼠全部存活;親本菌株以2.0×109cfu劑量接種時，5只小鼠全部死亡，說明⊿hfq突變株對小鼠的致病性是減弱

5、的。小鼠免疫攻毒試驗(yàn)表明⊿hfq突變株以2.0×109cfu劑量免疫兩次后，可耐受2.0×109cfu劑量親本菌株的攻擊，說明⊿hfq突變株具有良好的免疫原性。
　　本研究構(gòu)建了支氣管敗血波氏桿菌⊿hfq突變株。⊿hfq突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性和生長能力;⊿hfq突變株對小鼠的毒力顯著降低，初步明確hfq是與支氣管敗血波氏桿菌毒力相關(guān)的基因。⊿hfq突變株具有良好的免疫原性，可為研究其減毒新型疫苗提供可能性，也可為Bb致病機(jī)制的