豬痢疾短螺旋體的分離、鑒定與血清抗體ELISA檢測方法的建立.pdf

1、豬痢疾(SwineDysenterySD)是由豬痢疾短螺旋體（Brachyspirahyodysenteriae,B.hyodysenteriae,B.hyo）感染引起的，以大腸黏膜卡他性、出血性及壞死性炎癥、腹瀉、黏液性或黏液出血性下痢為特征的豬腸道傳染病。本病呈世界性分布，一旦侵入豬群，長期存在不易根除，仔豬的發(fā)病率和死亡率都較高，育肥豬患病后生長速度下降，飼料利用率降低，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，豬痢疾常用的診斷方法主要依

2、賴于病豬臨床癥狀和組織病變的觀察、以及PCR檢測技術(shù)，但由于不同感染豬群的臨床癥狀和組織病變差異較大，使臨床診斷舉步為艱;PCR檢測只能確定樣本中是否存在B.hyo的核酸，但不能獲得活的病原體，因此迫切需要建立一套快速又準(zhǔn)確的診斷豬群感染B.hyo情況的檢測方法。
　　 利用PCR檢測臨床樣本中B.hyo的保守的NADHoxidase（nox）基因，同時(shí)選擇鑒別培養(yǎng)基BAM-SR（BloodAgaroseMediumwithSp

3、ectinomycinandRifampicin，改良的含有壯觀霉素和利福平的血平板），采用厭氧袋厭氧培養(yǎng)法對(duì)PCR檢測陽性樣本進(jìn)行B.hyo的分離培養(yǎng)，對(duì)分離培養(yǎng)物進(jìn)行銀染法快速鏡檢，以及進(jìn)行16SrRNA基因序列比較與分析。成功的建立了一套實(shí)驗(yàn)室PCR檢測結(jié)合厭氧培養(yǎng)的快速分離鑒定B.hyo的方法。從采集的254份臨床豬大腸黏膜和糞便樣品中，PCR檢測出B.hyo陽性樣本13份，成功分離鑒定出1株B.hyo命名為SHB1。
　

4、　 利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，融合表達(dá)了具有種屬特異性和免疫原性的豬痢疾短螺旋體外膜脂蛋白Bhlp30.7。優(yōu)化了Bhlp30.7的表達(dá)與純化條件。將純化的Bhlp30.7蛋白作為包被抗原，建立了檢測豬血清中B.hyo抗體的間接ELISA方法，并優(yōu)化了間接ELISA檢測方法的各項(xiàng)條件。本實(shí)驗(yàn)融合表達(dá)了分子量為30.7KDa的目的蛋白;確立了濃度為0.1MIPTG的最佳誘導(dǎo)濃度和6h的最佳誘導(dǎo)時(shí)間;選擇了含100mM咪唑的結(jié)合緩沖液純化蛋白

5、;經(jīng)方陣滴定實(shí)驗(yàn)，確定2μg/mL的抗原為最佳包被濃度，待檢血清稀釋度的最佳稀釋度是200倍。
　　 利用融合表達(dá)的Bhlp30.7蛋白作為間接ELISA檢測方法的包被抗原，對(duì)上海周邊地區(qū)28個(gè)豬場共計(jì)609份豬血清樣本進(jìn)行檢測。對(duì)照各個(gè)豬場的豬痢疾病史和PCR檢測結(jié)果，使用陽性判斷值法(cut-offvalue)處理檢測結(jié)果，利用PCR檢測SD陰性和無SD病史豬場來源的血清的相對(duì)OD值，計(jì)算得到cut-off值為4.28(P＜