豬附紅細(xì)胞體JL-2基因的原核表達(dá)及重組蛋白間接ELISA方法的建立.pdf

1、豬附紅細(xì)胞體病是由豬附紅細(xì)胞體（Eperythrozoon suis）寄生于血漿、紅細(xì)胞表面或侵入紅細(xì)胞內(nèi)部，主要以貧血、黃疸、發(fā)熱等臨床癥狀為特征的血液性傳染病。
　　目前，對豬附紅細(xì)胞體病的防治尚無有效方法，而且在NCBI上可供研究的豬附紅細(xì)胞體基因甚少。為此，本試驗(yàn)對構(gòu)建的豬附紅細(xì)胞體基因組文庫進(jìn)行篩選，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及測序分析，獲得一個(gè)全長為929 bp，且在NCBI上無同源性的基因片段，應(yīng)用ORF Finder分析，發(fā)

2、現(xiàn)該基因片段含有438 bp的完整開放閱讀框，編碼145個(gè)氨基酸，與已知的豬附紅細(xì)胞體序列無同源性，暫命名為“豬附紅細(xì)胞體JL-2”。對ORF編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行同源性分析顯示，未發(fā)現(xiàn)具有同源性的蛋白，推測該蛋白很可能是豬附紅細(xì)胞體特有的一種蛋白。
　　通過對“豬附紅細(xì)胞體JL-2”基因的生物信息學(xué)分析，根據(jù)其最大ORF設(shè)計(jì)了一對帶有雙酶切位點(diǎn)的特異性引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，并與原核表達(dá)載體pGEX-4T-1連接，經(jīng)大腸桿菌 BL-21感

3、受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)以及SDS-PAGE電泳和Western blotting分析，該基因能夠在大腸桿菌BL-21中高效表達(dá)，表達(dá)重組蛋白的分子量為40.5 kDa，該重組蛋白能被豬附紅細(xì)胞體陽性血清所識別，并具有較好的反應(yīng)原性。
　　純化豬附紅細(xì)胞體 JL-2基因重組蛋白，以此為抗原，建立了豬附紅細(xì)胞體重組蛋白間接ELISA檢測方法。通過對ELISA各反應(yīng)條件的篩選，確定了抗原的最佳包被濃度為20.5g/mL，4℃過夜