禽呼腸孤病毒σ3蛋白基因的原核表達(dá)及重組蛋白抗原ELISA方法的建立.pdf

1、參考GeneBank上S1133株S1的基因序列，設(shè)計(jì)合成了一對(duì)含有酶切位點(diǎn)的引物，對(duì)ARV的S1133株的S1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增一段1014bp的基因片斷，然后克隆到表達(dá)載入PGEX-4T-1中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌，經(jīng)終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，高效表達(dá)了σ 3蛋白，融合蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的25﹪。經(jīng)Western-blot檢測(cè)表明，表達(dá)的融合蛋白能夠被ARV的陽性血清所識(shí)別，具有良好的抗原性。

2、利用表達(dá)的融合蛋白作為抗原，建立了檢測(cè)ARV抗體的間接ELISA方法，并對(duì)ELISA的反應(yīng)條件進(jìn)行了探索，確定了抗原的最適包被濃度為3.98 μ g/ml，檢測(cè)血清稀釋液為200倍稀釋，血清與抗原反應(yīng)最佳反應(yīng)時(shí)間為1.5小時(shí)，酶標(biāo)二抗最佳作用時(shí)間為1小時(shí)，底物的最佳顯色時(shí)間為25分鐘。采用已確立的ELISA反應(yīng)條件，檢測(cè)26份SPF雞的陰性血清，依據(jù)陰陽臨界值=陰性血清OD平均值+3SD，確定陰陽臨界值為0.4。用此方法檢測(cè)包被的抗原不