禽呼腸孤病毒σ3基因的真核表達(dá)及σNS基因的原核表達(dá)與序列分析.pdf

1、禽呼腸孤病毒(Avian reovirus,ARV)感染在世界范圍內(nèi)存在，主要引起雞和火雞的病毒性關(guān)節(jié)炎＼腱鞘炎，吸收障礙綜合癥和慢性呼吸道疾病。感染雞出現(xiàn)免疫抑制而引起繼發(fā)性感染，死亡率升高等等，造成比較大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來研究者對ARV，進(jìn)行了不同的檢測診斷方法及不同類型疫苗的探索。 課題分別對ARVσ3基因構(gòu)建的真核表達(dá)載體(pcDNA-σ3)、構(gòu)建的重組載體pcDNA-σ3的免疫效果、ARV非結(jié)構(gòu)蛋白σNS的克隆表達(dá)及

2、序列分析進(jìn)行了研究。 采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增禽呼腸孤病毒ARV S1133株的σ3基因，將σ3基因克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)載體上，獲得重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切以及序列分析鑒定，表明插入的片段為σ3目的基因，插入的位置、大小和閱碼框架均正確，成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體重組質(zhì)粒pcDNA-σ3。 分別制備pcDNA-σ3DNA疫苗、ARV滅活苗及σ3蛋白苗，將制備的疫苗分別免疫SPF雞(各10羽)2次后，用AR

3、V S1133株對DNA疫苗免疫組、滅活苗免疫組、σ3蛋白免疫組及對照組進(jìn)行攻毒。攻毒4天后采集雞的內(nèi)臟組織器官經(jīng)處理后使用RT-PCR方法進(jìn)行檢測。RT-PCR的檢測結(jié)果為DNA疫苗免疫組(10％)檢出率與對照組(30.9％)差異顯著(p<0.05)，與滅活苗免疫組(7.4％)及σ3蛋白免疫組(3.7％)差異不顯著(p>0.05)。說明用構(gòu)建的pcDNA-σ3免疫SPF雞，雞只獲得了較好的免疫保護(hù)。 研究還采用RT-PCR技

4、術(shù)，擴(kuò)增10株禽呼腸孤病毒σNS非結(jié)構(gòu)蛋白基因，將S1133株與廣西分離株R2的σNS基因克隆到表達(dá)載體PGEX-4T-1獲得重組質(zhì)粒(PGEX-1133-σNS，PGEX-R2- σNS)，其他8株的σNS基因克隆至PMDl8-T載體，對陽性質(zhì)粒進(jìn)行序列測定。對陽性重組質(zhì)粒IPTG的誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)溫度等條件進(jìn)行了試驗(yàn)。結(jié)果顯示，目的蛋白分子量約為66.2ku，約占菌體總量的31.5[％]-33.3[％]，IPTG最佳誘導(dǎo)濃度

5、為0.8mmol/L，最佳誘導(dǎo)時間為4 h，最適誘導(dǎo)溫度為28-37℃。37℃及32℃誘導(dǎo)時，目的蛋白σNS主要以包涵體的形式存在，28℃誘導(dǎo)時，目的蛋白σNS主要以可溶性的方式表達(dá)。利用28℃誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白σNS，用谷胱苷肽活化的Sepharose 4B親和層析柱純化，測定純化蛋白的濃度。結(jié)果顯示純化后目的蛋白純度達(dá)到93[％]，濃度為0.9lmg/ml。Westem—blotting分析表明，目的蛋白能夠與ARV陽性血清發(fā)生特異性