豬瘟病毒NS2-3蛋白抗原集中區(qū)基因的真核表達(dá).pdf

1、豬瘟(CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起一種高度接觸性和高致死性傳染病，給世界各國的養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重危害。近年來，隨著CSFV研究的深入，新型疫苗的研制和先進(jìn)診斷方法的出現(xiàn)，對控制CSF方面發(fā)揮了巨大作用。NS2-3蛋白是CSFV的非結(jié)構(gòu)蛋白，具有很好的免疫優(yōu)勢。
　　本研究從攜帶豬瘟兔化弱毒（HCLV）全長基因組cDNA質(zhì)粒中擴(kuò)增NS2-3基因的抗原表位集中區(qū)基因，擴(kuò)增長度為789bp，將其命名為NS2-32。將目的片段和表達(dá)

2、載體pPICZαC分別經(jīng)EcoR I和Xba I限制性內(nèi)切酶雙酶切，然后連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαC-NS2-32。經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后進(jìn)行測序鑒定，重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαC-NS2-32經(jīng)Sac I限制性內(nèi)切酶單酶切線性化之后，電擊轉(zhuǎn)化至P. pastoris工程菌感受態(tài)X-33。篩選出高抗性陽性菌株，通過改變溫度、培養(yǎng)基pH值、甲醇流加量，摸索誘導(dǎo)表達(dá)條件，誘導(dǎo)條件包括：(1)誘導(dǎo)溫度為：22℃、24℃、2

3、6℃、28℃；(2)誘導(dǎo)pH值為：4.0、5.0、6.0、7.0；(3)甲醇濃度為：0.4％、0.7％。對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，沒有出現(xiàn)特異性條帶。進(jìn)一步分析目的蛋白無法表達(dá)的可能原因和影響因素，包括密碼子的偏嗜性、A+T含量、過度糖基化、甲醇濃度、目的蛋白的降解和蛋白信號肽的影響等，排除了影響目的蛋白表達(dá)的條件因素，推測影響目的蛋白表達(dá)的關(guān)鍵因素可能是基因自身的特點(diǎn)，即稀有密碼子比率高和糖基化位點(diǎn)多，這需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證