小鵝瘟病毒VP3基因真核表達(dá)質(zhì)粒在小鼠中的免疫效果.pdf

1、小鵝瘟是由鵝細(xì)小病毒(Goose Parvovirus，GPV)引起的雛鵝急性或亞急性敗血性傳染病，以滲出性腸炎、小腸黏膜表層大片壞死脫落、腸道栓塞為特征性病變，該病主要侵害出殼后4～20日齡的雛鵝和番鴨。 自1956年我國學(xué)者方定一在江蘇揚(yáng)州首先發(fā)現(xiàn)并檢出小鵝瘟病毒以來，國內(nèi)外學(xué)者對小鵝瘟病毒展開了一系列的研究。我國養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展勢態(tài)好，而小鵝瘟是一種傳染速度快、發(fā)病率和死亡率可高達(dá)90％～100％的疾病，一旦爆發(fā)將給養(yǎng)鵝戶帶來巨

2、大的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)疫苗對GPV的預(yù)防和控制起到了一定的積極作用，但其自身也存在著不可避免的缺點(diǎn)，如滅活苗存在某些重要抗原表位的丟失，免疫原性差；弱毒苗容易發(fā)生毒力返祖，干擾檢疫等諸多問題，而應(yīng)用核酸疫苗則不存在這些問題。同傳統(tǒng)的滅活疫苗以及弱毒疫苗比較，核酸疫苗具有以下優(yōu)點(diǎn)：在機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，免疫時間長；避開了病原微生物，無感染的潛在危險；所需劑量低，只要ng水平即可發(fā)揮作用。 鵝細(xì)小病毒VP3基因是GPV主要保護(hù)性抗原基因，其

3、編碼的蛋白為病毒核衣殼的主要成分，約占總蛋白含量的80％，且暴露于病毒粒子表面，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和作用的抗體。對VP3基因真核表達(dá)質(zhì)粒的免疫效果進(jìn)行研究，為鵝細(xì)小病毒核酸疫苗的研制打下基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)將空載體質(zhì)粒pVAXⅠ和本實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建的、能夠高效率轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAXⅠ/VP3，通過堿裂解法進(jìn)行大量提取。用真核表達(dá)質(zhì)粒pVAXⅠ/VP3、空載體質(zhì)粒pVAXⅠ和生理鹽水分別肌肉注射免疫10只6周齡的BA

4、LB/c健康雌性小鼠，共免疫四次。 無菌條件下，取出免疫小鼠脾臟，分離淋巴細(xì)胞，以淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)胞內(nèi)酶MTT法應(yīng)用特異性抗原GPV刺激檢測T淋巴細(xì)胞的增殖程度，以流式細(xì)胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，通過SPSS11.5版統(tǒng)計軟件分析后，pVAXⅠ/VP3實(shí)驗(yàn)組、pVAXⅠ對照組和生理鹽水對照組三組的結(jié)果在T淋巴細(xì)胞增殖程度和細(xì)胞數(shù)量上均未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)的顯著水平。由此說明，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pV

5、AXⅠ/VP3誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生細(xì)胞免疫能力不強(qiáng)。這一結(jié)果與張中洋等報道的研究結(jié)果相似，但產(chǎn)生這種結(jié)果的原因目前尚不清楚，推測可能與免疫小鼠的生理狀況或個體差異及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)影響因素多等有關(guān)。 分離免疫小鼠的血清，并參照李茂祥老師的方法，采用2.2％NaCl、6％ PEG濃縮病毒，Sepharose-4B柱層析，提純GPV抗原。采用雙方陣滴定法確定純化的GPV抗原的最佳工作濃度為10μg/mL，免疫重組表達(dá)質(zhì)粒pVAXⅠ/VP3的

6、鼠混合血清的最佳工作稀釋度為1：600，以此建立檢測小鵝瘟特異性抗體的間接ELISA法。應(yīng)用上述建立的間接ELISA法檢測免疫小鼠血清中GPV特異性抗體的水平，通過SPSS11.5版統(tǒng)計軟件分析后pVAXⅠ/VP3免疫組分別與pVAXⅠ對照組和陰性生理鹽水對照組這兩個組別的GPV特異性抗體水平差異顯著，而pVAXⅠ對照組與陰性生理鹽水對照組的GPV特異性抗體水平無顯著差異。并且小鼠pVAXⅠ/VP3免疫組含有的GPV特異性抗體水平明顯高