豬瘟病毒E0基因在原核與真核表達(dá)系中的表達(dá).pdf

1、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文豬瘟病毒E0基因在原核與真核表達(dá)系中的表達(dá)姓名：陳振海申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：夏春王琴20030501中文摘要豬瘟病毒(classicalswinefevervirus，CSFV)E0糖蛋白既是包膜蛋白，又是一種核酸酶，其活性對(duì)病毒在宿主體內(nèi)的持續(xù)感染有直接關(guān)系。鑒于E0蛋白在病毒感染，誘導(dǎo)機(jī)體免疫及與宿主細(xì)胞相互關(guān)系中的作用，本研究克隆了2株豬瘟病毒EO基因并將其與其它毒株EO基因進(jìn)行了序列

2、分析，揭示了我國(guó)豬瘟病毒流行株之間的遺傳演化關(guān)系，為豬瘟病毒的流行病學(xué)研究提供依據(jù)。同時(shí)將兔化弱毒株E0基因分別置于原核與真核表達(dá)系中進(jìn)行了表達(dá)，并對(duì)重組蛋白進(jìn)行了初步的免疫學(xué)分析。首先，采用RTPCR和nestPCR技術(shù)擴(kuò)增了CSFVJL株和CSFVLN9912株E0基因，插入Teasy載體后測(cè)序，應(yīng)用DNAStar50和Bioedit軟件將其與本實(shí)驗(yàn)室已測(cè)其它毒株和GeneBank中登錄的CSFV代表毒株EO基因序列進(jìn)行比較繪制了遺

3、傳進(jìn)化樹并預(yù)測(cè)了E0蛋白的抗原表位、疏水性、等電點(diǎn)等特性。序列分析結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)室所測(cè)毒株可分為兩群，15株CSFVE0基因RNase活性的兩個(gè)氨基酸基序SLHGIWPE(或G)(2836位)和EWNKHGWC(75—82位)高度保守，僅5個(gè)疫苗株SLHGIWPE基序中的E替換為G，基序中位于30和79位的H為PHase催化活性關(guān)鍵氨基酸殘基，高度保守。其次，將豬瘟兔化弱毒株(HCLV)E0基因分別插入pGEX4T，pET30，pMAL

4、p2X中，并分別構(gòu)建了以BL21和BL21(DE3)codonplus，BL21(DE3)和BL21(DE3)codonplus，TBl和BL21(DE3)codonplus為宿主菌株的原核表達(dá)系。通過摸索IPTG誘導(dǎo)濃度，誘導(dǎo)溫度，菌體收獲時(shí)間等條件。確定了E0基因能在pGEX4T／BL21(DE3)codonplus和pMALp2X／BL21(DE3)eodonplus中高效表達(dá)表達(dá)產(chǎn)量分別占菌體總蛋白的15％和30％，表達(dá)的重組蛋

5、白主要為包涵體。分別采用Bper試劑和超聲波裂解配以曲通尿素對(duì)包涵體進(jìn)行洗滌兩種方法在pGEX表達(dá)系中取得了較好的效果。使用分步透析法對(duì)變性的包涵體進(jìn)行復(fù)性，將復(fù)性蛋白過GST親和層析柱得到純化的GSTE0融合蛋白。以GSTE0融合蛋白為診斷抗原，初步建立了用間接ELISA檢測(cè)豬瘟血清E0抗體的方法。此外，為了得到可溶性重組E0蛋白并便于觀察重組蛋白的表達(dá)情況，我們將EGFP基因與E0基因相連插入昆蟲桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中，與線性桿狀病毒D

6、NA共轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞后通過噬斑純化得到純的重組桿狀病毒，將其感染sf9細(xì)胞制備P1種子液。同時(shí)用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況剔除表達(dá)效果差的重組桿狀病毒。再用P1種子液感染sf9細(xì)胞制各高效價(jià)的P2種子液。通過病毒液的梯度稀釋和噬斑測(cè)定。確定P2種子液的病毒滴度達(dá)114X107pfu／ml。將P2種子液以MOI510接種指數(shù)期sf9細(xì)胞，三天后呈現(xiàn)出最強(qiáng)的熒光。我們還將EGFPE0融合基因插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pCIdhfr中