鵝副粘病毒HN和F基因克隆、序列分析及原核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、鵝副粘病毒(GPMV)是副粘病毒科,副粘病毒亞科,腮腺炎病毒屬,APMV-1中的成員,引起鵝副粘病毒病.該病自1997年由揚(yáng)州大學(xué)王永坤教授報(bào)道以來,在國內(nèi)很多地區(qū)的鵝群中流行.鵝副粘病毒病是以消化道病變?yōu)橹饕卣鞯木哂懈叨劝l(fā)病率和死亡率的烈性傳染病,給這些地區(qū)的養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失.初步實(shí)驗(yàn)表明,GPMV與傳統(tǒng)的NDV的致病性不同,并且常規(guī)的NDV疫苗不能提供有效的保護(hù).因此從分子生物學(xué)水平上對(duì)該病原進(jìn)行研究具有重要的意義.血凝

2、素-神經(jīng)氨酸酶(HN)糖蛋白和融合(F)糖蛋白是GPMV的兩種主要的囊膜糖蛋白.HN糖蛋白具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶兩種活性,F糖蛋白的裂解能力是病毒毒力的主要決定因素.該研究根據(jù)GenBank發(fā)表的GPMVSF02株及其它NDV全基因序列,借助Oligo4.1軟件,分別設(shè)計(jì)兩對(duì)和一對(duì)引物,分別采用RT-巢式PCR和RT-PCR方法對(duì)鵝副粘病毒JS/1/97/Go株的HN基因和F基因進(jìn)行了體外擴(kuò)增,擴(kuò)增出與預(yù)期設(shè)計(jì)大小相符的HN基因和F基因

3、的特異性條帶.將擴(kuò)增出的DNA片段克隆到pMDl8-T載體中,轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)AMP/IPTG/X-gal平板篩選,酶切和PCR鑒定后獲得陽性重組質(zhì)粒.序列測(cè)定表明:HN基因全長(zhǎng)1716bp,編碼571個(gè)氨基酸殘基,與參考序列比較,核苷酸的同源性為82.1﹪-98.4﹪,推導(dǎo)氨基酸同源性為88.3﹪-99.5﹪,有4個(gè)糖基化位點(diǎn),其中3個(gè)高度保守.F基因全長(zhǎng)為1662bp,編碼553個(gè)氨基酸殘基,與參考序列相比,核苷酸的同源性為

4、84.2﹪-99.8﹪,氨基酸同源性為87.7﹪-99.8﹪,有6個(gè)糖基化位點(diǎn),其中5個(gè)高度保守.F蛋白裂解位點(diǎn)的氨基酸順序?yàn)?'112>R-R-Q-K-R-F<'117>,與NDV的強(qiáng)毒株特征相符.根據(jù)測(cè)序結(jié)果,利用DNAstar軟件預(yù)測(cè)抗原表位,參考測(cè)得的HN基因的序列設(shè)計(jì)一條引物,擴(kuò)增HN基因5'端的含有三個(gè)抗原表位的基因片段(命名為HNp),測(cè)序結(jié)果表明長(zhǎng)為606bp,編碼201個(gè)氨基酸殘基,與HN全長(zhǎng)基因的相應(yīng)區(qū)域同源性比較,

5、核苷酸和氨基酸殘基各有2個(gè)變異,但不改變表位預(yù)測(cè)結(jié)果.將HN基因和HNp基因亞克隆到原核表達(dá)載體pProEX HTb中,將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α中.將F基因分別亞克隆到原核表達(dá)載體pGEX-6P-1和原核表達(dá)載體pET-30a(+)中,將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到TGl中.該實(shí)驗(yàn)克隆了JS/1/97/Go株的HN基因和F基因,根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析,并與參考的NDV毒株進(jìn)行了核苷酸和推導(dǎo)氨基酸的同源性比較,為證實(shí)GPMV和