條斑紫菜TPS基因的原核表達(dá)及重組蛋白的純化.pdf

1、本研究目的是實(shí)現(xiàn)條斑紫菜TPS基因（PyTPS）的高效原核表達(dá)并純化出重組蛋白，為研究重組蛋白的TPS與TPP酶活性奠定基礎(chǔ);同時實(shí)現(xiàn)PyTPS基因片段的高效原核表達(dá)并純化重組蛋白，為利用重組蛋白作抗原制備抗血清并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株中PyTPS基因表達(dá)的ELISA檢測奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　 1、克隆了PyTPS基因1.3Kb的片段。
　　 從條斑紫菜葉狀體提取總DNA并作模板，通過PCR擴(kuò)增獲得了PyTPS基因的1.

2、3Kb特異性擴(kuò)增帶?；厥占s1.3Kb的特異擴(kuò)增片段，然后進(jìn)行T-A克隆。經(jīng)PCR檢測及NdeⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ限制性酶切鑒定，篩選出了陽性克隆，其重組質(zhì)粒被命名為pGEM-PyTPS-1.3。序列測定結(jié)果表明pGEM-PyTPS-1.3中的插入片段就是PyTS基因1.3Kb片段，長1359bp，編碼453個氨基酸，推導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物為51KDa。
　　 2、實(shí)現(xiàn)了PyTPS基因的原核表達(dá)，并從包涵體中純化出了目的蛋白。
　

3、　 工程菌載體BL21（pET-PyTPS）在37℃，用1mMIPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)5小時后，SDS-PAGE顯示蛋白圖譜上有一條約100kDa的誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白條帶，其大小與預(yù)期的融合蛋白相符。用溶菌酶裂解菌體，提取總蛋白，SDS-PAGE顯示表達(dá)的融合蛋白主要以包涵體的形式存在。對包涵體中的目的蛋白用鎳離子親和層析柱進(jìn)行了純化，得到了高純度的目的蛋白，復(fù)性后可以可以用于酶活性的檢測。
　　 3、從上清中純化出了水溶性目的蛋白。

4、r>　　 工程菌載體BL21（pET-PyTPS）經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，提取菌體蛋白，電泳顯示上清中也有目的蛋白。上清經(jīng)過濃縮后，可純化出的水溶性的目的蛋白且純度很高，直接用于酶活性的檢測。
　　 4、實(shí)現(xiàn)了PyTPS基因1.3Kb片段的原核表達(dá)，并對純化條件進(jìn)行了研究。
　　 以pBAD/Thio-TOPO為起始載體，構(gòu)建了PyTPS基因1.3Kb片段的原核表達(dá)載體pBAD-PyTPS-1.3。工程菌TOP10（pBAD-P