豬附紅細胞體病PCR診斷方法的建立和去脾豬附紅細胞體病的研究.pdf

1、附紅細胞體病是由附紅細胞體(Eperythrozoon)寄生于多種動物的紅細胞表面、血漿及骨髓中引起的一種人畜共患病。關(guān)于附紅細胞體的分類地位目前仍有爭議，傳統(tǒng)的分類學方法將附紅細胞體列為立克次氏體，但是近年來16SrRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果表明，附紅細胞體更接近于支原體(Mycoplasma)。豬的附紅細胞體病主要引起仔豬發(fā)熱、貧血蒼白、黃疸和母豬流產(chǎn)等癥狀，常與其他豬病混合感染危害嚴重，防治十分困難，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。

2、 直接鏡檢是目前臨床上診斷該病的主要手段，包括鮮血壓片和涂片染色，但該方法假陽性較多見。動物實驗是確診的手段之一，但所費時間太久。血清學診斷方法包括間接血凝試驗(IHA)、補體結(jié)合試驗(CFT)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等，但由于附紅細胞體抗體水平的變化沒有規(guī)律而常出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。鑒于上述原因，為了建立特異準確的診斷方法，本研究開展了附紅細胞體病的聚合酶鏈式反應(PCR)診斷方法的研究。 根據(jù)已報道的附紅細胞體基

3、因組的序列(序列號AJ504999)設計了一對引物，建立了特異性的聚合酶鏈式反應，擴增片段大小為782bp，然后將擴增產(chǎn)物測序，測序結(jié)果與GenBank上豬附紅細胞體序列進行同源性比較，同源性達到99％。特異性試驗表明只有豬附紅細胞體模板可以擴增出特異性條帶，而健康豬血液、弓形蟲、豬偽狂犬病毒、多殺性巴氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌樣品沒有該條帶。利用建立的PCR方法對湖北、河南省的15個豬場進行了PCR檢測，結(jié)果有8個豬場為陽性，陽性率最高

4、的達到83.3％，平均陽性率為26.4％。在此基礎上又設計了一條引物，建立了半巢式PCR，敏感性試驗結(jié)果表明最低檢測出0.061fg的質(zhì)粒DNA濃度。本研究建立的豬附紅細胞體病PCR診斷方法為附紅細胞體的體外培養(yǎng)、病原學研究及該病的診斷和致病機理的研究等奠定了基礎。 本研究還對摘除脾臟的豬感染豬附紅體，進行了試驗性豬附紅細胞體病的研究。感染豬出現(xiàn)了皮膚發(fā)紅、出現(xiàn)紫斑、眼瞼腫脹、體溫升高等癥狀。試驗豬感染E.suis后紅細胞數(shù)量、

5、血紅蛋白數(shù)沒有明顯變化，表明貧血不明顯；葡萄糖有顯著降低：血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶都有升高的趨勢：半巢式PCR方法從接種后第1d起即可監(jiān)測到，持續(xù)到試驗結(jié)束。但利用姬姆薩涂片染色監(jiān)測染蟲率沒有明顯上升。 另外，本研究從自然感染附紅細胞體的湖北黃牛無菌采集血液，分離附紅細胞體并提取病原基因組，用血營養(yǎng)菌的16SrRNA基因的通用引物進行PCR擴增，得到長約1.5Kb的擴增片段，將其克隆到pMD18-T載體后進行測序和分析。結(jié)果表