利用RNAi技術(shù)抗棉蚜的研究.pdf

1、RNAi作用是細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA（dsRNA）在Dicer酶的作用下形成~22bp大小的小干擾RNA（siRNA），siRNA在Ago蛋白的作用下組裝到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）中，從而對(duì)靶標(biāo)mRNA進(jìn)行切割消化從而抑制其表達(dá)翻譯。這種基于序列特異性dsRNA對(duì)特定基因的沉默作用自其發(fā)現(xiàn)就具有用來對(duì)昆蟲的基因進(jìn)行下調(diào)而達(dá)到抗蟲并使害蟲致死的潛能。在傳統(tǒng)的抗蚜方法一切弊病日顯嚴(yán)重的情況下，迫切需要尋找新的抗蟲策略。而利用RNAi方

2、法抗蟲可以有效抵抗蟲害，并且安全，而且昆蟲進(jìn)化不易產(chǎn)生對(duì)其抗性，這些優(yōu)點(diǎn)使得RNAi方法成為新的抗蟲策略的首選。
　　 Mao等人在煙草和擬南芥中表達(dá)了靶向棉鈴蟲細(xì)胞色素P450基因CYP6AE14的dsRNA，當(dāng)棉鈴蟲進(jìn)食轉(zhuǎn)基因植物后，體內(nèi)該基因的表達(dá)量明顯發(fā)生下降，表明發(fā)生dsRNA對(duì)棉鈴蟲體內(nèi)該基因發(fā)生沉默作用。Baum的研究中發(fā)現(xiàn)靶向V型ATP酶A基因(V-ATPase A)的dsRNA可以有效地對(duì)內(nèi)源性的mRNA產(chǎn)生沉

3、默作用。
　　 在利用RNAi進(jìn)行抗蚜蟲研究時(shí)，一方面需要選擇效率高的靶標(biāo)dsRNA，另一方面需要產(chǎn)生高通量的dsRNA，此外還要保證轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的dsRNA可以在昆蟲進(jìn)食時(shí)運(yùn)輸?shù)嚼ハx體內(nèi)并發(fā)揮RNAi作用。因此本研究中選擇了的靶標(biāo)dsRNA基因有V-ATPase A，組織蛋白酶基因Cathepin B，核糖體蛋白R(shí)ibosomal protein L18，vesicle-fusing ATPase（小囊泡融合ATPase基因

4、）。另外，由于蚜蟲在進(jìn)食植物時(shí)，以口器吸食植物韌皮部營(yíng)養(yǎng)成分，為刺吸式進(jìn)食，因此研究中選擇了韌皮部特異性表達(dá)的雙向啟動(dòng)子RolC來表達(dá)dsRNA，并且結(jié)合ToMV病毒的外殼蛋白和起始組裝序列（OAS）對(duì)病毒RNA的包裹作用，在雙向啟動(dòng)子的另一端表達(dá)了ToMV的CP蛋白基因，以期可以產(chǎn)生對(duì)dsRNA一定的包裹作用而在昆蟲進(jìn)食時(shí)運(yùn)輸?shù)嚼ハx中腸內(nèi)發(fā)揮RNAi作用，并且對(duì)于頸環(huán)結(jié)構(gòu)的dsRNA的環(huán)形結(jié)構(gòu)序列結(jié)構(gòu)選擇了ToMV病毒的OAS。

5、>　　 研究中針對(duì)所選的基因構(gòu)建5個(gè)韌皮部特異性表達(dá)的干擾載體，雙向啟動(dòng)子一端表達(dá)dsRNA，另一端表達(dá)CP蛋白基因。構(gòu)建成功的干擾載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法導(dǎo)入到野生型擬南芥中，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行PCR鑒定。另外還對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行RT-PCR和Northern檢測(cè)干擾載體在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的RNA表達(dá)情況。此外還對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥接種棉蚜，進(jìn)行抗蚜數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)檢測(cè)其抗蚜效價(jià)。
　　 實(shí)驗(yàn)中成功構(gòu)建了5個(gè)韌皮部特異性表達(dá)的干擾載體