利用RNAi技術(shù)沉默玉米sbeIIb的研究.pdf

1、玉米是一種重要的糧食和經(jīng)濟(jì)作物，種植和應(yīng)用比較廣泛，玉米籽粒中含有直鏈淀粉和直鏈淀粉。在工業(yè)方面，直鏈淀粉是重要的工業(yè)原料，可用于生產(chǎn)生物降解薄膜、膠卷、高級包裝材料、工業(yè)酒精以及作為紡織加漿的原料。在食品制作方面，直鏈淀粉屬于抗消化淀粉，食用后人體血糖水平不易升高，可用于糖尿病、肥胖、高血壓、膽結(jié)石等病人的保健食品。從普通玉米淀粉中提取直鏈淀粉的成本很高，只有高直鏈玉米淀粉才具有商業(yè)開發(fā)價(jià)值。高直鏈玉米淀粉在美國和歐洲已經(jīng)商品化，我國

2、還沒有高直鏈玉米淀粉品種規(guī)?；虡I(yè)種植。
　　 本文利用RNAi技術(shù)沉默玉米sbeⅡb，提高玉米直鏈淀粉的含量，進(jìn)行研究，同時(shí)建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的優(yōu)良玉米自交系的遺傳轉(zhuǎn)化體系，對玉米基因工程育種具有十分重要的意義。本文主要研究結(jié)果如下:
　　 1玉米幼胚是目前遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用最多的外植體。以5個(gè)玉米自交系丹黃25、P138、陜814、齊319、H21為材料，通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了玉米幼胚繼代培養(yǎng)基，對5個(gè)自交系幼胚誘導(dǎo)情況進(jìn)行了方差分

3、析。對幼胚培養(yǎng)過程中的出現(xiàn)的褐化現(xiàn)象進(jìn)行了分析，通過控制胚齡長短和在繼代培養(yǎng)基中添加某些成分抑制愈傷組織的褐化，提高幼胚愈傷組織的活性。結(jié)果表明，基因型不同的玉米自交系，胚齡時(shí)間為9-15天接種，在丹黃25胚齡11天，H21和P138胚齡13天時(shí)活力較強(qiáng)，褐化率較低，繼代培養(yǎng)基中加入2mg/L的2，4-D，10g/L的甘露醇，10mg/L的脯氨酸和硝酸銀的作用下，抑制褐化作用顯著。
　　 2利用pBAC3300、pBAC407、

4、pBAC413構(gòu)建新質(zhì)粒，將sbeⅡb的部分序列及啟動子作為RNAi的目標(biāo)序列，構(gòu)建pQAU1和pQAU2載體。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切片端驗(yàn)證。
　　 3建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的優(yōu)良玉米自交系的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并優(yōu)化農(nóng)桿菌LBA4404侵染幼胚的條件，在菌液的OD值為0.5，AS濃度為10mmol/L，侵染時(shí)間為20mins，幼胚培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)基因型可能產(chǎn)生差異，但是丹黃25和陜814幼胚培養(yǎng)23天，避光恒

5、溫恢復(fù)培養(yǎng)72h，幼胚愈傷組織的活性較好。
　　 4篩選抗性愈傷組織后，配制分化培養(yǎng)基，生根壯苗培養(yǎng)基，促進(jìn)愈傷組織分化成苗。以pBAC3300質(zhì)粒中存在的FAD2intron基因構(gòu)建引物，提取幼苗的總DNA，以特定FAD2intron基因構(gòu)建引物進(jìn)行PCR檢測。上游引物:5'-AGCAGATCTATCGTGAGCGG-3'下游引物為5'-GAAGACTCTCTTGAATCGTTACC-3'經(jīng)PCR反應(yīng)后，用0.8％的瓊脂糖凝膠