利用RNAi技術(shù)研究CTSD和MMP1在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、鼻咽癌是我國(guó)南方五省及東南亞地區(qū)高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤之一，其發(fā)病的分子機(jī)制仍未闡明。目前，普遍認(rèn)為EB病毒感染、遺傳因素和化學(xué)致癌物是導(dǎo)致鼻咽癌發(fā)生的三大主要原因。 鼻咽癌的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致鼻咽癌治療失敗的主要原因，但目前對(duì)于鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制人們知之甚少。因此，進(jìn)一步篩選和鑒定鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，并明確其在鼻咽癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用，對(duì)于揭示鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制有著重要意義，也對(duì)鼻咽癌的治療及預(yù)后判斷具有重要的理論和實(shí)用價(jià)值。

2、 鼻咽癌細(xì)胞5-8F和6-10B均來(lái)源于同一母細(xì)胞株SUNE-1，既往的研究已經(jīng)證實(shí)，5-8F具有高成瘤、高轉(zhuǎn)移能力，而6-10B則只成瘤、不轉(zhuǎn)移。我們實(shí)驗(yàn)室利用深圳微芯公司生產(chǎn)的8046個(gè)點(diǎn)基因芯片比較了5-8F/6-10B之間差異表達(dá)基因，獲得一些差異表達(dá)的基因，其中CTSD和MMP1為已知的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，芯片的數(shù)據(jù)提示這兩個(gè)基因可能在鼻咽癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。 人CTSD基因的過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，是惡性

3、腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)之一。文獻(xiàn)報(bào)道該基因的過(guò)表達(dá)與多種惡性腫瘤，如乳腺癌、大腸癌、胃癌以及前列腺癌等的轉(zhuǎn)移相關(guān)，同時(shí)也有文獻(xiàn)報(bào)道CTSD在鼻咽癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮作用，但仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)其作用。 人MMP1基因在腫瘤演進(jìn)的多個(gè)階段均有作用，它影響腫瘤的起始、生長(zhǎng)、血管生成、進(jìn)入血管/離開(kāi)血管等過(guò)程。流式細(xì)胞分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pLentiU6空白載體的5-8F細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的5-8F-E細(xì)胞的細(xì)胞周期分布沒(méi)有明顯改變；轉(zhuǎn)染pLenti

4、U6/CTSDshRNA的5-8F-EGFP細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的5-8F-EGFP細(xì)胞比較，細(xì)胞周期也沒(méi)有明顯的變化。這些數(shù)據(jù)表明抑制CTSD基因的表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株5-8F-EGFP細(xì)胞周期沒(méi)有明顯的影響。 利用Boyden侵襲小室模型比較了轉(zhuǎn)染pLentiU6空白載體的5-8F-EGFP細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的5-8F-EGFP細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染pLentiU6/CTSDshRNA的5-8F-EGFP細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染空載體pLentiU

5、6對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力沒(méi)有明顯的影響，但是轉(zhuǎn)染干擾載體pLentiU6/CTSDshRNA后則能夠顯著性的降低細(xì)胞穿過(guò)ECMatrix膜的能力。這一結(jié)果表明，抑制CTSD基因的表達(dá)能夠降低鼻咽癌細(xì)胞株的侵襲轉(zhuǎn)移能力。 進(jìn)一步，將上述三種細(xì)胞分別原位接種到裸鼠的鼻咽部，觀察它們的轉(zhuǎn)移能力的變化。結(jié)果表明空載體對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力基本上沒(méi)有影響，而抑制CTSD基因表達(dá)后，在一定程度上能降低接種動(dòng)物的轉(zhuǎn)移能力，但這種影響并不顯著。

6、 第二部分：利用RNAi干擾技術(shù)研究MMP1基因在5-8F-EGFP細(xì)胞中的作用 這一部分主要是觀察抑制鼻咽癌細(xì)胞株5-8F-EGFP中MMP1基因的表達(dá)后對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力的影響，實(shí)驗(yàn)方法與第一部分相同。先針對(duì)靶基因MMP1構(gòu)建了2個(gè)RNAi載體：pLentiU6/MMP1shRNA1和pLentiU6/MMP1shRNA2。經(jīng)測(cè)序結(jié)果證實(shí)后，PCR證實(shí)外源DNA已整合到細(xì)胞基因組DNA中，熒光定量RT-PCR結(jié)果表明，pL

7、entiU6/MMP1shRNA1和pLentiU6/MMP1shRNA2表達(dá)載體都能特異性的引起靶基因CTSD的表達(dá)下調(diào)，其中MMP1shRNA1對(duì)目的基因的干擾效果為76％，而MMP1shRNA2對(duì)目的基因的干擾效果僅為57％。進(jìn)一步，WesternBlotting分析表明MMP1shRNA1片段的干擾效率為71.2％，而MMP1shRNA2片段的干擾效率只有59.4％。這些數(shù)據(jù)表明我們已成功地建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pLentiU6/MMP1

8、shRNA的5-8F-EGFP細(xì)胞系，并且MMP1shRNA1片段的干擾效率比MMP1shRNA2片段的干擾效率要高。 流式細(xì)胞分析抑制MMP1基因表達(dá)對(duì)5-8F-EGFP細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示干擾前后細(xì)胞的周期無(wú)顯著改變；用MTT法測(cè)定抑制MMP1基因表達(dá)對(duì)5-8F-EGFP細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示干擾前后細(xì)胞的生長(zhǎng)也無(wú)明顯變化；Boyden侵襲小室實(shí)驗(yàn)觀察抑制MMP1基因表達(dá)對(duì)5-8F-EGFP細(xì)胞穿ECMatrix膜的能

9、力的影響，結(jié)果顯示抑制MMP1基因的表達(dá)能夠顯著性地降低細(xì)胞穿過(guò)ECMatrix膜的能力。分別原位接種干擾前后的兩種細(xì)胞到裸鼠的鼻咽部，觀察兩者轉(zhuǎn)移能力的改變，結(jié)果顯示10只接種干擾MMP1的5-8F細(xì)胞，9只原位成瘤，只有5只出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移率為5/9，而10接種未干擾的5-8F細(xì)胞，8只原位成瘤，8只均有轉(zhuǎn)移灶出現(xiàn)，轉(zhuǎn)移率為8/8。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明抑制MMP1基因的表達(dá)對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的沒(méi)有顯著的影響。 第三部分：用RNAi干擾技

10、術(shù)研究同時(shí)抑制CTSD和MMP1基因?qū)?-8F-EGFP細(xì)胞的作用 腫瘤的侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜而又連續(xù)的過(guò)程，牽涉眾多的基因共同作用和調(diào)節(jié)。為研究CTSD和MMP1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力的影響是否同時(shí)存在作用，我們將上述實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的針對(duì)CTSD和MMP1兩個(gè)基因的RNAi載體通過(guò)共轉(zhuǎn)染的方法導(dǎo)入到鼻咽癌細(xì)胞系5-8F-EGFP中，殺稻瘟菌素篩選獲得抗性克隆，PCR證實(shí)外源DNA已整合到細(xì)胞基因組DNA中，WesternBlotti

11、ng檢了鼻咽癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程。 RNAi技術(shù)和可視化技術(shù)是近幾年腫瘤研究領(lǐng)域發(fā)展起來(lái)的前沿技術(shù)。RNAi是研究基因功能和進(jìn)行基因治療的全新技術(shù)，更是后基因組時(shí)代進(jìn)行基因功能高通量研究的強(qiáng)有力的工具。哈佛大學(xué)的研究者利用這一技術(shù)一次對(duì)果蠅的16000個(gè)基因進(jìn)行了發(fā)育相關(guān)功能研究，從中發(fā)現(xiàn)了300多個(gè)與發(fā)育相關(guān)的基因，如果利用傳統(tǒng)技術(shù)，這是無(wú)法想象的。另外由于RNAi具有高效、特異的靶向作用與沉默機(jī)制，使其成為治療某些傳統(tǒng)難治之癥(如惡

12、性腫瘤、AIDS等)的希望。 利用可視化技術(shù)建立的腫瘤動(dòng)物模型可以幫助研究者在整體動(dòng)物水平適時(shí)觀察腫瘤的生長(zhǎng)、演進(jìn)和轉(zhuǎn)移的情況。該技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于腫瘤轉(zhuǎn)移以及抗癌藥物的研究等眾多領(lǐng)域中，Hoffman領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室利用可視化技術(shù)建立了一系列的MetaMouse，為藥物篩選和腫瘤轉(zhuǎn)移研究提供了良好的動(dòng)物模型。我們實(shí)驗(yàn)室利用這一技術(shù)在國(guó)際上首次建成了可視化的鼻咽癌轉(zhuǎn)移模型，該模型是研究鼻咽癌轉(zhuǎn)移的極佳動(dòng)物模型。 本研究是在前

13、期利用芯片篩選出在高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞株5-8F中高表達(dá)的兩個(gè)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因CTSD和MMP1的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用RNAi技術(shù)和可視化動(dòng)物模型技術(shù)在細(xì)胞和動(dòng)物整體水平上分析這兩個(gè)基因在鼻咽癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用，為闡明鼻咽癌的分子機(jī)制提供直接證據(jù)。實(shí)驗(yàn)的方法和結(jié)果如下： 第一部分：利用RNAi干擾技術(shù)研究CTSD基因在5-8F-EGFP細(xì)胞的作用 采用pLentiU6慢病毒載體系統(tǒng)，構(gòu)建了針對(duì)靶基因CTSD的1個(gè)RNAi載體pLe

14、ntiU6/CTSDshRNA。經(jīng)測(cè)序結(jié)果證實(shí)后，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將pLentiU6/CTSDshRNA導(dǎo)入5-8F細(xì)胞，殺稻瘟菌素篩選獲得抗性克隆，PCR證實(shí)外源DNA已整合到細(xì)胞基因組DNA中，熒光定量RT-PCR結(jié)果表明，pLentiU6/CTSDshRNA表達(dá)載體能特異性的引起靶基因CTSD的表達(dá)下調(diào)，下調(diào)效果為83％。進(jìn)一步，WesternBlotting分析表明整合pLentiU6/CTSDshRNA細(xì)胞中CTSD蛋白表達(dá)

15、下調(diào)了70％，這些數(shù)據(jù)表明我們已成功地建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pLentiU6/CTSDshRNA的5-8F細(xì)胞系。 為觀察抑制CTSD基因的表達(dá)對(duì)鼻咽癌的生物學(xué)特性和轉(zhuǎn)移能力的改變，測(cè)細(xì)胞克隆中CTSD和MMP1兩個(gè)基因的干擾效果，篩選出同時(shí)抑制CTSD和MMP1表達(dá)的細(xì)胞克隆。 接下來(lái)我們比較了同時(shí)抑制CTSD和MMP1基因表達(dá)的5-8F-EGFP與僅抑制MMP1基因表達(dá)以及未轉(zhuǎn)染的5-8F-EGFP三種細(xì)胞在生長(zhǎng)能力、細(xì)胞周期

16、以及細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的差異，發(fā)現(xiàn)同時(shí)抑制CTSD和MMP1對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)能力以及細(xì)胞的周期均沒(méi)有明顯的影響，但對(duì)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力有著明顯的影響。說(shuō)明MMP1與CTSD基因在介導(dǎo)鼻咽癌的轉(zhuǎn)移方面可能是同肘起作用的。 總之，我們利用RNAi技術(shù)分別和聯(lián)合干擾鼻咽癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系5-8F細(xì)胞中CTSD和MMP1基因的表達(dá)，觀察了它們對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、細(xì)胞周期以及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無(wú)論是單獨(dú)還是聯(lián)合干擾CTSD和MMP1，