ECRG4在鼻咽癌組織中的表達及其在鼻咽癌惡性生物學行為中作用與機制的研究.pdf

1、目的：
　　在本研究中，我們分別應用RT-PCR以及Western-blot方法識別ECRG4在鼻咽癌組織以及細胞系等方面的mRNA與蛋白表達狀態(tài);通過免疫組化研究ECRG4在鼻咽癌方面的表達狀態(tài)以及統(tǒng)計學要素，同時明確和臨床病理的具體聯(lián)系;建立ECRG4過表達脂質(zhì)體，使用transwell以及裸鼠尾實驗來明確ECRG4對細胞系5-8F、CNE2相關(guān)侵襲以及轉(zhuǎn)移所構(gòu)成的基礎影響;Western blot研究ECRG4對于轉(zhuǎn)移表達存

2、在的基礎影響;進一步使用RT-PCR以及明膠酶譜法來研究MMP2的mRNA表達以及酶活性;調(diào)整MMP2的表達，transwell觀察MMP2對于ECRG4控制侵襲轉(zhuǎn)移的基礎影響;Western blot研究NF-kB p65的磷酸化狀態(tài);進行增殖以及克隆等實驗，同時明確裸鼠身體中的成瘤實驗ECRG4對于增殖能力所構(gòu)成的基礎影響;使用流式細胞儀的方案研究ECRG4對細胞周期所存在的影響;Western blot研究ECRG4對于配套調(diào)控蛋

3、白所產(chǎn)生的基礎影響。
　　課題包含以下三個部分:第一部分:ECRG4在鼻咽癌組織和細胞中的表達及意義;第二部分:ECRG4通過NF-kB下調(diào)MMP2的表達抑制鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移;第三部分: ECRG4抑制鼻咽癌細胞的增殖
　　第一部分 ECRG4在鼻咽癌組織和細胞中的表達及意義
　　1.培養(yǎng)3個人鼻咽癌細胞系(5-8F、6-10B、CNE2)和1個永生化鼻咽上皮細胞系(NP69)。
　　2.收集河南省人民醫(yī)院及鄭

4、大一附院2006年至2012年切除的鼻咽癌組織及正常鼻咽組織石蠟標本。
　　3.采用免疫組化的方法檢測鼻咽癌組織及正常鼻咽組織的ECRG4的表達。
　　4.收集2例活檢的鼻咽癌新鮮組織及7例正常鼻咽組織。
　　結(jié)果:
　　1、ECRG4在鼻咽癌組織中的表達明顯低于癌旁組織
　　針對2例活檢癌變組織和7例健康組織進行對比分析，研究其中的蛋白以及mRNA水平的ECRG4表達狀態(tài)，最終得出不管是在mRNA或蛋白水

5、平中，ECRG4于鼻咽癌組織方面的表達都明顯低于正常的組織。
　　2、ECRG4在鼻咽癌細胞系中的表達
　　Western-Blot以及RT-PCR分析得出，ECRG4實際檢測的3種癌變細胞6-10B、CNE2中都存在一定的表達，實際的表達量都低于永生化的上皮細胞系，同時得出存在高轉(zhuǎn)移特征的5-8F細胞系，在實際的表達水平方面顯著低于不轉(zhuǎn)移性以及低轉(zhuǎn)移性的CNE2細胞系。
　　3、ECRG4在鼻咽癌組織中表達的臨床病理

6、學意義
　　為有效分析ECRG4于鼻咽癌、正常組織之中存在的表達差異，筆者在分析環(huán)節(jié)中擴充樣本規(guī)模，整理153例鼻咽癌以及30例非癌石蠟組織開展配套的檢查工作，最終得出ECRG4于鼻咽癌方面集中于胞漿，較少的存在于胞核的位置。深入分析可得出ECRG4于非癌組織的高表達數(shù)量為28例(93.3％)，低表達的數(shù)量為2例(6.7％)，而對于鼻咽癌方面而言，構(gòu)成高表達的數(shù)量為81例(52.9％)，構(gòu)成低表達的數(shù)量為72例(47.1％)，兩類

7、組織的表達狀況存在顯著的區(qū)別，同時其中的區(qū)別存在顯著的統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　　4、ECRG4在鼻咽癌組織中表達的臨床病理學意義
　　深入探討ECRG4于鼻咽癌方面的實際表達狀況和臨床病理學特征的基礎聯(lián)系時得出，ECRG4的實際表達狀態(tài)和病忠實際的性別、年齡以及抽煙等并不存在顯著的聯(lián)系。而ECRG4表達強度和EB、浸潤、分化、TNM分期和轉(zhuǎn)移等存在密切的聯(lián)系。即存在EB病毒感染問題的病患，在ECRG4陽性表達率方面

8、低于無EB感染的群體;而伴隨實際腫瘤分化度提升的同時，ECRG4表達率會相對更高;而在腫瘤分期較晚的情況下，ECRG4表達率則會相對更低;存在遠處及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的實際陽性率顯著低于不存在轉(zhuǎn)移問題的群體，而兩個組別的數(shù)據(jù)差異存在一定的統(tǒng)計學價值，p＜0.01。Kaplan-Meier生存期研究得出ECRG4實際的表達狀況和病患的預后存在緊密的聯(lián)系，ECRG4低表達的病患，在各種生存期參數(shù)上都顯著低于ECRG4高表達的群體。
　　第二部

9、分:ECRG4通過NF-kB下調(diào)MMP2的表達抑制鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移
　　方法:
　　1、ECRG4-pcDNA3.1載體的構(gòu)建。
　　2、構(gòu)建ECRG4、MMP2過表達載體。
　　3、構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1載體的鼻咽癌細胞系。
　　4、Transwell小室實驗測定5-8F、CNE2細胞和相關(guān)對照細胞具體的遷移與侵襲表現(xiàn)。
　　結(jié)果:
　　1、將p3.1/ECRG4-pcDNA3.11、

10、p3.1/ECRG4-pcDNA3.12和p3.1空載體轉(zhuǎn)染鼻咽癌5-8F以及CNE2細胞系，通過G418而開展配套的陽性克隆篩選工作，進一步得到可實現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效果的對應6株細胞系，將其名稱依次界定為5-8F/pcDNA3.11、5-8F/pcDNA3.12、5-8F/control、CNE2/ pcDNA3.11、CNE2/pcDNA3.12以及CNE2/ control。成功構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1載體的鼻咽癌細胞系。

11、　　2、上調(diào)ECRG4的表達抑制鼻咽癌細胞的遷移和侵襲能力
　　與轉(zhuǎn)染p3.1空載體細胞相比，ECRG4-pcDNA3.11、ECRG4-pcDNA3.12轉(zhuǎn)染造成5-8F細胞方面的遷移細胞數(shù)依次降低78.3％與65.1％，而關(guān)于其中的侵襲細胞實際的降低比例則屬于70.4％以及59.8％。進而令CNE2細胞實際的遷移細胞數(shù)降低82.5％以及52.7％，而侵襲細胞數(shù)的減少幅度屬于76.9％以及69.4％。體外遷移以及相關(guān)的侵襲實驗得

12、出，上調(diào)細胞中的ECRG4表達可以有效的抑制鼻咽癌細胞所存在的基礎遷移以及侵襲效應，代表著ECRG4或許具備抑制癌細胞侵襲效應的對應能力。
　　3、ECRG4影響鼻咽癌細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達
　　為有效的論述ECRG4怎樣控制鼻咽癌細胞方面存在的遷移以及侵襲效應。在分析中采用Western blot來測定轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，探尋ECRG4潛在的相關(guān)靶基因。而在大量的和腫瘤轉(zhuǎn)移存在聯(lián)系的基因中，實際選定了曾報道為屬于ECRG4基礎

13、裂解底物的MMP2、MMP9、Snail、P-catenin和VimentinE-cadherin，、N-cadherin，最終得出上調(diào)ECRG4的表達，能夠控制鼻咽癌MMP2、Snail以及Vimentin的表達，體會E-cadherin的對應表達，同時MMP9、N-cadherin以及P-catenin在表達水平上并不存在顯著的變化。
　　4、上調(diào)ECRG4的表達降低鼻咽癌細胞內(nèi)MMP2的表達水平及其酶活性
　　細胞外基

14、質(zhì)降解作為相關(guān)的腫瘤細胞對于周邊存在浸潤，以及對于遠處存在侵襲、轉(zhuǎn)移等變化的必要基礎，當前眾多的分析得出基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs和轉(zhuǎn)移之間存在極為緊密的聯(lián)系，例如MMP2于多類腫瘤轉(zhuǎn)移之中起到一定的重要影響，尤其是MMP2也加入到鼻咽癌轉(zhuǎn)移效應中。最新的分析得出ECRG4可下調(diào)MMP2的表達，進而抑制相關(guān)肝內(nèi)膽管細胞癌所存在的轉(zhuǎn)移變化。所以綜合前文中Western blot的對應結(jié)果，推測ECRG4影響轉(zhuǎn)移或許涉及MMP2的調(diào)節(jié)效應。針對

15、該問題，使用RT-PCR在5-8F、CNE2兩個細胞系方面再度驗證上調(diào)ECRG4表達可導致MMP2表達的下降。進而依靠配套的明膠酶譜法而識別MMP2的酶活性狀態(tài)。最終得出于5-8F、CNE2兩個細胞系之中進行上調(diào)ECRG4的活動，都會導致MMP2酶活性的顯著下降。
　　第三部分 ECRG4抑制鼻咽癌細胞的增殖
　　方法:
　　1、細胞生長曲線的測定（CCK8實驗）。
　　2、細胞平板集落形成實驗
　　3、流

16、式細胞儀分析細胞周期
　　4、裸鼠體內(nèi)成瘤實驗
　　結(jié)果:
　　1、上調(diào)ECRG4抑制細胞增殖標志蛋白PCNA的表達
　　2、上調(diào)ECRG4的表達顯著降低鼻咽癌細胞的體外增殖能力
　　3、上調(diào)ECRG4的表達顯著地抑制鼻咽癌細胞克隆形成能力
　　4、上調(diào)ECRG4表達抑制鼻咽癌細胞體內(nèi)成瘤能力
　　結(jié)論:
　　1、發(fā)現(xiàn)ECRG4在鼻咽癌組織的表達明顯低于正常鼻咽組織;發(fā)現(xiàn)ECRG4在鼻咽癌

17、組織中的表達水平與EB病毒的感染、組織的分化程度、TNM分期、腫瘤的體積和轉(zhuǎn)移相關(guān);
　　2、發(fā)現(xiàn)上調(diào)ECRG4的表達可以明顯抑制鼻咽癌細胞轉(zhuǎn)移、侵襲、增殖和成瘤能力;
　　3、ECRG4抑制鼻咽癌細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲，可能是通過依賴NF-kB信號通路下調(diào)MMP2的表達來實現(xiàn);
　　4、上調(diào)ECRG4的表達可以阻止鼻咽癌細胞由G1期向S期進展，使細胞停滯于G0/1期，其潛在的機制可能是部分通過下調(diào)Cyclin D1、Cyc