Flotillin-2在鼻咽癌中的表達(dá)及作用機(jī)制的初步探索.pdf

1、鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是東南亞和我國(guó)南方省份高發(fā)的惡性腫瘤。其病因可能涉及EB病毒感染、化學(xué)致癌物作用及基因突變和表觀遺傳學(xué)變異等多個(gè)因素。
　　 鼻咽癌細(xì)胞系5-8F和6-10B是從SUNE-1細(xì)胞系中分離出的兩個(gè)亞系，雖然遺傳背景相同，但是它們的轉(zhuǎn)移能力差別很大。本課題組利用這一特點(diǎn)，通過(guò)抑制性消減雜交技術(shù)，構(gòu)建了兩株細(xì)胞間差異表達(dá)基因的消減cDNA文庫(kù)，從中篩選出了一批在高轉(zhuǎn)移鼻

2、咽癌細(xì)胞系5-8F中表達(dá)上調(diào)的基因，進(jìn)一步挑選出Flotillin-2(FLOT2)基因進(jìn)行后續(xù)研究。
　　 FLOT2蛋白最早是在金魚視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突再生過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的，它具有廣泛的生物學(xué)功能，參與軸突再生、神經(jīng)元分化、胞吞作用、T淋巴細(xì)胞活化、脂筏構(gòu)成、膜蛋白招募及促進(jìn)黑色素瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移等過(guò)程。
　　 前期工作中，利用RNA干擾方法降低5-8F細(xì)胞系中FLOT2基因的表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)5-8F細(xì)胞系增殖、侵襲、運(yùn)動(dòng)

3、、轉(zhuǎn)移能力均下降，而G1期細(xì)胞比例增加。這些結(jié)果提示FLOT2可能與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　 本研究在前期工作的基礎(chǔ)之上，檢測(cè)了各種鼻咽癌細(xì)胞系中FLOT2基因mRNA的表達(dá)水平。同時(shí)，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了38例慢性鼻咽炎患者、45例未轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者和87例轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者組織切片中FLOT2蛋白的表達(dá)水平。接著抽提了穩(wěn)定干擾FLOT2基因的5-8F細(xì)胞總RNA，進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)分析，并對(duì)部分芯片結(jié)果進(jìn)行了

4、初步的驗(yàn)證。最后對(duì)FLOT2基因啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，利用Wnt信號(hào)通路激活劑BIO刺激5-8F和6-10B細(xì)胞，于不同時(shí)間檢測(cè)FLOT2表達(dá)水平和啟動(dòng)子活性。
　　 RT-PCR結(jié)果顯示，在鼻咽癌細(xì)胞系中，5-8F、HNE-1、HNE-2、HNE-3、CNE-1、CNE-2、HONE-1、HK-1、C666-1九個(gè)細(xì)胞系中表達(dá)較強(qiáng)的FLOT2，而6-10B細(xì)胞中FLOT2 mRNA的表達(dá)水平最低，但仍高于NP69正常鼻

5、咽上皮細(xì)胞系。免疫組化結(jié)果顯示，從慢性鼻咽炎組織到未轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織，再到轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織中，F(xiàn)LOT2的表達(dá)水平依次升高(P＜0.001)?；虮磉_(dá)譜芯片和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LOT2基因干擾后，5-8F細(xì)胞中p53信號(hào)通路活化，TGF-β信號(hào)通路被抑制，多個(gè)細(xì)胞粘附相關(guān)分子、細(xì)胞周期相關(guān)分子表達(dá)水平發(fā)生了明顯的變化。RT-PCR和/或定量PCR結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)LOT2表達(dá)下調(diào)后，與鼻咽癌轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān)的E-cadherin以及細(xì)胞周期負(fù)相關(guān)因

6、子p21表達(dá)均明顯上調(diào)。
　　 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LOT2基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp范圍內(nèi)存在多個(gè)啟動(dòng)子和Wnt信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。我們構(gòu)建了包含F(xiàn)LOT2啟動(dòng)子和Wnt信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告基因載體。BIO刺激后48h，6-10B與5-8F細(xì)胞內(nèi)FLOT2基因啟動(dòng)子區(qū)域活性明顯上調(diào)，F(xiàn)LOT2表達(dá)水平也明顯上調(diào)。
　　 綜合上述結(jié)果，我們得出以下結(jié)論:FLOT2在鼻咽癌細(xì)胞系和組織中