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1、鼻咽癌(NasopharyngealCarcinoma,NPC)是一種主要發(fā)生在我國(guó)南方地區(qū)的鼻咽部的惡性上皮性腫瘤。研究表明,在NPC化療中,含鉑類方案的治療效果要優(yōu)于非鉑類方案,而在鉑類方案中最常用的是順鉑。目前認(rèn)為腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制非常復(fù)雜,比較引人關(guān)注的就是耐藥細(xì)胞如何能夠阻斷順鉑與DNA的結(jié)合,而其中能把毒性藥物泵出細(xì)胞外而使藥物蓄積減少的ABC(ATPbindingcassette,ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族就成為了研
2、究的熱點(diǎn)。 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用機(jī)制主要是通過(guò)其跨膜區(qū)域與底物結(jié)合,通過(guò)水解ATP產(chǎn)生能量而把底物泵出細(xì)胞外。目前發(fā)現(xiàn)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族共有48個(gè)基因,根據(jù)跨膜區(qū)域的不同可分為A、B、C、D、E、F、G七個(gè)亞族,其中常見(jiàn)的與耐藥相關(guān)的基因有十個(gè):ABCA2、ABCB1(也稱為MDR1、P-gp)、ABCC1(也稱為MRP1)、ABCC2(也稱為MRP2、cMOAT)、ABCC3、ABCC4、ABCC5、ABCC6、ABCC11
3、、ABCG2。 方法: 1.從臨床收集具備臨床預(yù)后資料的病例,根據(jù)對(duì)順鉑化療的情況分為敏感組和不敏感組,通過(guò)免疫組化SP法檢測(cè)ABCC2的表達(dá)水平,然后對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量積分法分析。統(tǒng)計(jì)分析ABCC2的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤分期、化療效果及預(yù)后的關(guān)系。同時(shí)根據(jù)化療的方案分為PF(DDP+5-Fu)、PFB(DDP+5-Fu+平陽(yáng)霉素)、PFD(DDP+5-Fu+艾素)及PV(DDP+長(zhǎng)春新堿)組,并與ABCC2的表達(dá)情況進(jìn)
4、行統(tǒng)計(jì)分析。 2.對(duì)CNE2細(xì)胞用順鉑單獨(dú)誘導(dǎo)以及用順鉑+5-氟脲嘧啶聯(lián)合進(jìn)行誘導(dǎo),經(jīng)誘導(dǎo)一年左右,用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化:MTT法檢測(cè)多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑PSC833作用前后順鉑對(duì)耐藥細(xì)胞及敏感細(xì)胞的抑制率,并計(jì)算出IC50以及耐藥指數(shù);熒光定量PCR法檢測(cè)十種常見(jiàn)的與耐藥相關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在誘導(dǎo)前后mRNA的變化,免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)ABCC2蛋白質(zhì)的表達(dá)情況;高效液相色譜法檢測(cè)PSC833作用
5、前后耐藥細(xì)胞內(nèi)順鉑蓄積的變化情況。 3.利用已構(gòu)建的ABCC2慢病毒干擾載體,對(duì)CNE2細(xì)胞進(jìn)行RNA干擾,篩選出穩(wěn)定的干擾株,用熒光定量PCR法檢測(cè)ABCC2在干擾前后mRNA的變化;WesternBlot法和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)干擾前后ABCC2蛋白表達(dá)的情況;用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化;MTT法檢測(cè)干擾前后順鉑對(duì)細(xì)胞的抑制情況并計(jì)算出IC50:高效液相色譜法檢測(cè)干擾前后細(xì)胞內(nèi)順鉑蓄積的變化情況
6、。最后通過(guò)裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)來(lái)探討干擾克隆在體內(nèi)對(duì)DDP的敏感性。 結(jié)果: 1、鼻咽癌組織中ABCC2表達(dá)及臨床意義 (1)共收集84例NPC標(biāo)本。SP免疫組化結(jié)果表明,ABCC2表達(dá)主要定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿,少數(shù)可見(jiàn)表達(dá)于細(xì)胞核。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,ABCC2的表達(dá)與患者的年齡、性別、臨床分期的相關(guān)性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 (2)84例標(biāo)本中化療敏感組為50例,其中ABCC2高表達(dá)的占34%(17/5
7、0):不敏感組為34例,其中ABCC2高表達(dá)的占65%(22/34),兩組ABCC2的表達(dá)有顯著性差異(Z=3.71,P<0.01),不敏感組中ABCC2的表達(dá)要高于敏感組,提示ABCC2的表達(dá)與化療效果有關(guān)。進(jìn)一步對(duì)化療方案與ABCC2的表達(dá)情況進(jìn)行分析,結(jié)果表明ABCC2的表達(dá)與PFB、PFD、NP等聯(lián)合化療方案的療效的相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而與PF方案的療效有關(guān)(Z=1.481,P<0.05) (3)84例標(biāo)本中有轉(zhuǎn)移的為7
8、4例,其中ABCC2高表達(dá)的有36例(50%);未轉(zhuǎn)移的10例,其中ABCC2高表達(dá)的有3例(30%),兩組ABCC2的表達(dá)有顯著性差異(Z=2.05,P<0.01),轉(zhuǎn)移組中ABCC2的表達(dá)要高于未轉(zhuǎn)移組,提示ABCC2的表達(dá)與轉(zhuǎn)移有關(guān)。進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組中化療效果與ABCC2表達(dá)的關(guān)系進(jìn)行探討,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移組中,化療不敏感組中ABCC2的表達(dá)顯著高于化療敏感組(Z=3.52,P<0.01)。 2、耐藥細(xì)胞株的鑒定及A
9、BCC2表達(dá)的檢測(cè) (1)用DDP誘導(dǎo)CNE212個(gè)月(CNE2/DDP)、DDP+-5Fu聯(lián)合誘導(dǎo)CNE212個(gè)月(CNE2/DDP+5Fu)后,MTT法檢測(cè)PSC833作用前后DDP對(duì)三種細(xì)胞的抑制情況,計(jì)算出IC50,結(jié)果表明與CNE2相比,CNE2/DDP、CNE2/DDP+5Fu對(duì)順鉑更加耐藥,并能被PSC833部分逆轉(zhuǎn)。通過(guò)比較IC50,CNE2/DDP對(duì)順鉑的耐藥性增加了2.63倍,逆轉(zhuǎn)后降為1.63倍;而聯(lián)合誘導(dǎo)
10、耐藥的CNE2/DDP+5Fu對(duì)順鉑的耐藥性增加了5.35倍,逆轉(zhuǎn)后降為4.62倍。 (2)MTT法檢測(cè)三種細(xì)胞的增殖能力,繪制生長(zhǎng)曲線,結(jié)果表明三種細(xì)胞增殖能力沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.192,P>0.05);流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也表明三種細(xì)胞的細(xì)胞周期變化也不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.142,P>0.05)。 (3)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)三組細(xì)胞中十種常見(jiàn)的與耐藥有關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果表明在兩株耐藥細(xì)胞中只有
11、ABCC2的表達(dá)均上調(diào),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=37.24,P<0.05)。CNE2/DDP中ABCC2的表達(dá)增高了1.73倍,CNE2/DDP+5Fu中ABCC2的表達(dá)增高了3.96倍。 (4)細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)三組細(xì)胞中ABCC2蛋白表達(dá)的情況,結(jié)果表明CNE2/DDP、CNE2/DDP+5Fu細(xì)胞中ABCC2蛋白的表達(dá)明顯上調(diào),并且在更耐藥的CNE2/DDP+5Fu細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)ABCC2還可在細(xì)胞核中表達(dá)。 (5)高效液
12、相色譜法檢測(cè)PSC833逆轉(zhuǎn)前后細(xì)胞內(nèi)順鉑蓄積變化的情況,結(jié)果表明逆轉(zhuǎn)前DDP在耐藥細(xì)胞中的蓄積減少,順鉑在細(xì)胞內(nèi)的蓄積分別減少了2.07倍(CNE2/DDP)和2.82倍(CNE2/DDP+5Fu);逆轉(zhuǎn)后順鉑在細(xì)胞的蓄積有所增加,DDP在細(xì)胞內(nèi)的蓄積在CNE2/DDP細(xì)胞中降為1.35倍,在CNE2/DDP+5Fu細(xì)胞中降為1.36倍。 3、ABCC2表達(dá)下調(diào)對(duì)CNE2細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 (1)利用已構(gòu)建好的慢病毒
13、干擾載體,包裝慢病毒后,用含有干擾載體的慢病毒感染CNE2細(xì)胞,殺稻瘟菌素篩選抗性克隆,約14天后,挑取抗性單克隆并擴(kuò)大培養(yǎng),篩選3個(gè)月后,利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各克隆的ABCC2表達(dá)情況,篩選出干擾效率較高的兩個(gè)克隆(66.1%、66.8%)為下一步實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。 (2)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,與陰性對(duì)照和CNE2細(xì)胞相比,兩個(gè)干擾克隆中細(xì)胞的增殖速度沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.063,P>0.05);流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也表明
14、各組細(xì)胞中細(xì)胞周期的變化不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.181,P>0.5)。 (3)MTT法檢測(cè)細(xì)胞干擾前后對(duì)順鉑敏感性的變化,結(jié)果表明干擾后細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增加,兩株干擾克隆與CNE2相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=4.08,P<0.05),分別增加了3.96倍和3.42倍。 (4)高效液相色譜法檢測(cè)干擾前后細(xì)胞內(nèi)順鉑蓄積的變化,結(jié)果表明ABCC2表達(dá)下調(diào)后,順鉑在兩株干擾克隆細(xì)胞內(nèi)的蓄積增加,與CNE2相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(
15、F=97.23,P<0.01),分別增加了2.66倍和3.11倍。 (5)以DDP敏感性最高的CNE2/pshRNA-ABCC2-1作裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn),免疫組化結(jié)果表明,在裸鼠體內(nèi)CNE2/pshRNA-ABCC2-1克隆中ABCC2仍維持于低表達(dá)水平;然后計(jì)算出平均相對(duì)腫瘤體積及相對(duì)腫瘤增殖率,結(jié)果表明經(jīng)DDP作用后,CNE2/shABCC2-1相對(duì)腫瘤體積減少,生長(zhǎng)減慢,與CNE2、陰性對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均小于0
16、.05)。 結(jié)論: 1、ABCC2的表達(dá)與鼻咽癌組織對(duì)含順鉑化療的療效特別是PF(即DDP+5-氟脲嘧啶)方案有關(guān),并且與轉(zhuǎn)移有關(guān),提示可考慮將ABCC2的表達(dá)情況作為預(yù)示NPC患者的化療效果和預(yù)后的指標(biāo)之一: 2、成功構(gòu)建出兩株耐藥細(xì)胞株,分別對(duì)DDP耐藥(CNE2/DDP)及對(duì)DDP、5-氟脲嘧啶耐藥(CNE2/DDP+5Fu)。耐藥細(xì)胞株中ABCC2表達(dá)增加,同時(shí)耐藥細(xì)胞內(nèi)DDP蓄積減少,其細(xì)胞對(duì)DDP的耐
17、藥性更高。 3、成功篩選出兩株ABCC2表達(dá)減少的干擾克隆,其細(xì)胞內(nèi)順鉑蓄積增加,對(duì)順鉑也更加敏感。裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)也證明在DDP作用后干擾組的腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制。 4、本研究表明ABCC2的表達(dá)與NPC對(duì)DDP耐藥之間的關(guān)系密切。本研究的創(chuàng)新之處1、通過(guò)免疫組化SP法證實(shí)ABCC2的表達(dá)與鼻咽癌組織對(duì)含DDP化療特別是PF方案的療效有關(guān),并且與患者的轉(zhuǎn)移有關(guān),并提出為可將ABCC2的表達(dá)情況作為預(yù)示NPC患者的化療
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