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文檔簡介
1、[目的]
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我國華南地區(qū)的高發(fā)性惡性腫瘤,研究表明其發(fā)病除與EB病毒感染、化學(xué)致癌物有關(guān)外,與遺傳易感基因也有密切的關(guān)系。近年來,RNA干擾(RNA interference,RNAi)的研究進(jìn)展非常迅速,這項(xiàng)技術(shù)極有可能用于腫瘤臨床治療。本研究擬從基因治療的角度出發(fā),首先在細(xì)胞水平上研究以RNAi的方式抑制人鼻咽癌低分化細(xì)胞株CNE-2中人端粒酶末端逆轉(zhuǎn)錄
2、酶(human telomerase reverse transcriplase,hTERT)和Bax抑制因子-1(Bax inhibitor-1,Bi-1)基因的表達(dá)對細(xì)胞增殖和凋亡的影響,其次通過建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型從動物整體水平研究以RNAi方式抑制上述兩個靶基因后基因表達(dá)的變化和對腫瘤生長的影響,從而探討治療鼻咽癌的新策略。
[方法]
首先,用以前篩選構(gòu)建的重組質(zhì)粒:即以pcDNA3.1(+)為載
3、體構(gòu)建的含T7啟動子的shRNA真核表達(dá)載體shRNA-TR、shRNA-Bi-1、shRNA-TR-Bi-1和各自的陰性對照載體,hTERT和Bi-1基因的最佳干擾靶點(diǎn)為(hTERT,gi:AF015950,2474~2492位;Bi-1,gi:23271944,738~760位)。用LipofectamineTM2000(Lip)將各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2內(nèi),并用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測轉(zhuǎn)染率;用MTT法觀察干擾載體及
4、轉(zhuǎn)染試劑對CNE-2細(xì)胞生長增殖的影響;測量Caspase-3活性并結(jié)合FCM來檢測細(xì)胞凋亡;用Real-Time PCR法檢測shRNA重組質(zhì)粒對hTERT和Bi-1基因表達(dá)的抑制效果;用Western-blot觀察抑制相關(guān)基因后其蛋白質(zhì)表達(dá)的變化;采用Hoechst33258染色,并用熒光顯微鏡觀察鼻咽癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化;用細(xì)胞創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移能力的變化;用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞克隆形成能力。
其次,建立鼻
5、咽癌裸鼠移植瘤模型;用上述重組質(zhì)粒與Lip的混合物瘤內(nèi)注射后測量腫瘤體積及計(jì)算腫瘤生長抑制率,繪制生長曲線;用HE染色觀察瘤組織病理改變;用Real-time PCR法檢測各重組質(zhì)粒作用瘤組織后hTERT和Bi-1基因mRNA表達(dá)情況;用免疫組化檢測各重組質(zhì)粒作用瘤組織后hTERT和Bi-1蛋白的表達(dá)情況;并用TUNEL法檢查腫瘤組織細(xì)胞凋亡。
[結(jié)果]
體外水平結(jié)果:Lip對質(zhì)粒pEGFP-N1的轉(zhuǎn)染率為6
6、6.26%。分別轉(zhuǎn)染7種shRNA的重組質(zhì)粒(pcDNA3.1(+)、shRNA-TR、shRNA-TRs、shRNA-Bi-1、shRNA-Bi-1s、shRNA-TR-Bi-1、shRNA-TR-Bi-1s)后,shRNA-TR、shRNA-Bi-1和shRNA-TR-Bi-1組的CNE-2細(xì)胞生長增殖能力降低,其中shRNA-TR-Bi-1組的生長增殖能力最低(P<0.01);轉(zhuǎn)染shRNA-TR、shRNA-Bi-1和shRNA
7、-TR-Bi-1重組質(zhì)粒后,熒光顯微鏡下可見部分鼻咽癌細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化;與未處理組相比,shRNA-TR、shRNA-Bi-1和shRNA-TR-Bi-1組中hTERT和Bi-1的mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.01)且蛋白的表達(dá)也相應(yīng)減弱。細(xì)胞的遷移能力、克隆形成能力均有所降低,其中以shRNA-TR-Bi-1組更明顯(P<0.05)。
體內(nèi)觀察結(jié)果:成功建立鼻咽癌移植瘤模型:與未處理組、Lip組和pcDN
8、A3.1(+)相比,用各重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體的復(fù)合物治療后,shRNA-TR、shRNA-Bi-1和shRNA-TR-Bi-1組的瘤體積增長減慢,瘤組織出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象及病理性改變,以shRNA-TR-Bi-1組更明顯;shRNA-TR、shRNA-Bi-1和shRNA-TR-Bi-1組中瘤組織hTERT和Bi-1的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)且蛋白表達(dá)也相應(yīng)減弱。
[結(jié)論]
Lip介導(dǎo)靶向作用人hT
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