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文檔簡介
1、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)高發(fā)于我國南方及東南亞地區(qū),而在北美和其他西方國家的白人中少見。流行病學(xué)及病因?qū)W研究表明,鼻咽癌的發(fā)病與遺傳因素、EB病毒感染和環(huán)境因素有關(guān)。鼻咽癌顯著的種族易感性和家族聚集現(xiàn)象表明,遺傳因素特別是瘤基因的激活和抑瘤基因的失活在鼻咽癌發(fā)病中具有十分重要的作用,因此尋找鼻咽癌遺傳易感基因是防治鼻咽癌的關(guān)鍵。
kank1基因是kank家族的一個重要成員,位于9p24
2、.3區(qū)域。研究顯示,Kank1在腦、肺、腎腫瘤組織及相應(yīng)的細胞系中存在雜合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)和啟動子區(qū)甲基化,導(dǎo)致該基因表達下調(diào)/缺失,提示kank1基因可能是一個抑瘤基因。鼻咽癌組織比較基因組雜交(comparative genomic hybridization,CGH)的結(jié)果顯示,染色體9p存在高頻率LOH,隨后將高頻缺失定位在更精細的9p21.3-p24.3區(qū)域。這些研究結(jié)果高度提示,
3、在9p21.3-p24.3可能存在與鼻咽癌相關(guān)的抑瘤基因。目前已發(fā)現(xiàn)該區(qū)的抑瘤基因有p16、NGX6和kank1等,而kank1基因與鼻咽癌的關(guān)系尚未見報的。因此,本研究開展kank1基因在鼻咽癌中的表達情況、失活機制、功能及其臨床病理學(xué)意義研究。
1、kank1基因在鼻咽癌中的表達研究
采用RT-PCR、Real-time RT-PCR方法檢測kank1mRNA在正常鼻咽上皮細胞系NP69、4株鼻咽癌細胞系(CNE
4、1、CNE2、5-8F、6-10B)、11例非癌組織和77例鼻咽癌組織中的表達。結(jié)果顯示,kank1在正常鼻咽細胞系NP69和幾乎全部非癌組織均有表達,而在4株鼻咽癌細胞系和大于50%的鼻咽癌組織中表達下調(diào)或缺失。Western blotting結(jié)果顯示,kank1蛋白在60%(12/20)的鼻咽癌組織中表達下調(diào)。結(jié)果表明,鼻咽癌中kank1基因存在高頻率的表達下調(diào)/缺失。
2、kank1基因在鼻咽癌中表達下調(diào)的機制研究
5、> 由于kank1位于鼻咽癌的高頻缺失區(qū)域,而基因內(nèi)部及其附近微衛(wèi)星位點的丟失可以間接反映該基因的缺失情況。為此,我們采用PCR-變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-銀染方法,分析kank1基因上下游的D9S1858和WI-12779二個微衛(wèi)星位點在鼻咽癌組織中的雜合性缺失情況。啟動子區(qū)DNA異常甲基化是抑瘤基因表觀遺傳學(xué)改變最為常見的方式,生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)kank1啟動子區(qū)存在CpG島。我們采用甲基化特異性PCR分析鼻咽癌組織kank1啟動子
6、甲基化情況。結(jié)果顯示,鼻咽癌組織D9S1858和WI-12779發(fā)生LOH的頻率分別為31.4%(11/35)和34.3%(12/35),kank1基因LOH的頻率為51.4%(18/35);鼻咽癌細胞株和鼻咽癌組織中kank1基因全部存在甲基化,而正常組織中甲基化頻率為60%(6/10)。提示kank1等位基因LOH和啟動子高甲基化可能是導(dǎo)致其在鼻咽癌中表達下調(diào)/缺失的重要原因。
3、鼻咽癌細胞kank1的功能研究
7、 為了探討kank1在鼻咽癌發(fā)病中的作用,我們采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將kank1表達質(zhì)粒和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高成瘤高轉(zhuǎn)移5-8F鼻咽癌細胞,建立kank1高表達的5-8F鼻咽癌細胞系(5-8Fkank1)和對照細胞系(5-8Fvector)。隨后觀察kank1表達上調(diào)對5-8F細胞生物學(xué)特征的影響。MTT分析結(jié)果顯示,5-8Fkank1細胞的增殖速度明顯低于5-8Fvector細胞和未轉(zhuǎn)染細胞(p<0.05);軟瓊脂集落形成實驗的結(jié)果顯示,5-8
8、Fkank1細胞的克隆形成率明顯低于5-8Fvector細胞和未轉(zhuǎn)染細胞(p<0.05);流式細胞術(shù)分析的結(jié)果顯示,與5-8Fvector細胞和未轉(zhuǎn)染細胞相比,5-8Fkank1細胞Go/G1期細胞比例明顯增加(p<0.05),S期和G2/M期細胞比例明顯減少(p<0.05);流式細胞術(shù)和Hoechst33258染色結(jié)果顯示,5-8Fkank1細胞的凋亡明顯高于5-8Fvector細胞和未轉(zhuǎn)染細胞(p<0.05);細胞體外遷移和侵襲實驗
9、顯示,與5-8Fvector細胞和未轉(zhuǎn)染細胞相比,5-8Fkank1細胞的運動能力和侵襲能力均明顯降低(p<0.05)。研究結(jié)果提示,kank1具有抑制鼻咽癌細胞增殖、促進鼻咽癌細胞凋亡以及抑制鼻咽癌細胞體外遷移和侵襲的作用。
4、kank1的臨床病理意義分析
為探討鼻咽癌kank1表達下調(diào)/缺失的臨床病理意義,我們采用免疫組化(IHC)染色檢測kank1在14例非癌組織和69例鼻咽癌組織中的表達。結(jié)果顯示,kank
10、1在72.5%(50/69)的鼻咽癌組織中表達下調(diào),而在14例正常鼻咽粘膜上皮中只有1例表達下調(diào)。Kank1表達下調(diào)/缺失與鼻咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期負相關(guān),kank1表達下調(diào)/缺失的鼻咽癌更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期更晚,而與腫瘤組織學(xué)類型、原發(fā)灶大小、患者的性別和年齡無關(guān)。
本文研究結(jié)果表明,kank1基因在非癌組織中穩(wěn)定表達,在鼻咽癌組織和細胞中表達明顯下調(diào)或缺失,LOH和啟動子區(qū)甲基化可能是導(dǎo)致kank1基因表達下調(diào)的
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