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文檔簡介
1、目的: 本研究擬選取fascin-1基因為研究對象,探索其與鼻咽癌預(yù)后的關(guān)系和在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的作用及其作用機制,為判斷鼻咽癌的預(yù)后、預(yù)測鼻咽癌轉(zhuǎn)移傾向及基因靶向治療奠定理論基礎(chǔ)。該研究成果可能直接應(yīng)用于鼻咽癌發(fā)病、轉(zhuǎn)移等機制的研究、新藥研發(fā)及臨床療效評價等多個方面,將產(chǎn)生良好的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。 方法: 1.fascin-1蛋白在人上皮性腫瘤組織中的表達(dá) 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測303例人類上皮性腫瘤組
2、織標(biāo)本及80例相應(yīng)正常組織標(biāo)本中fascin-1蛋白的表達(dá),303例上皮性腫瘤包括26例肺癌、33例宮頸癌、22例卵巢癌、38例食管癌、24例胰腺癌、23例胃癌、29例喉癌、17例原發(fā)性肝癌、34例大腸癌、33例乳腺癌、24例鼻咽癌。采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,兩組間比較采用Fisher精確概率法檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。 2.fascin-1在鼻咽癌中的表達(dá) 采用Westernblot方法檢測fascin-1蛋
3、白在鼻咽癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況。采用免疫組織化學(xué)方法檢測194例鼻咽癌組織標(biāo)本和33例鼻咽慢性炎癥組織fascin-1蛋白的表達(dá)。fascin-1表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)統(tǒng)計方法采用非參數(shù)Kruskal-WallisH檢驗;生存分析采用Kaplan-meier統(tǒng)計;fascin-1與鼻咽癌預(yù)后的臨床意義采用Coxproportionalhazardsregression統(tǒng)計。 3.fascin-1表達(dá)沉默對鼻咽癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響
4、 構(gòu)建特異性干擾fascin-1的慢病毒干擾載體。利用fascin-1慢病毒干擾載體沉默5-8F和CNE1鼻咽癌細(xì)胞fascin-1表達(dá),利用Westernblot方法檢測干擾效果。利用MTT體外生長實驗和平板克隆形成實驗評價fascin-1對NPC細(xì)胞增殖能力的影響;利用細(xì)胞劃痕實驗評價fascin-1對細(xì)胞運動能力的影響;利用體外侵襲實驗評價fascin-1對細(xì)胞侵襲能力的影響;利用細(xì)胞與基質(zhì)相互作用實驗評價在不同的基質(zhì)中fas
5、cin-1對細(xì)胞偽足和細(xì)胞膜皺褶形成的影響。體外生長實驗采用析因統(tǒng)計方法,平板克隆形成實驗、細(xì)胞劃痕實驗及體外侵襲實驗采用2樣本t檢驗。 結(jié)果: 1.fascin-1蛋白在人上皮性腫瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義 fascin-1在正常組織中,主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞,因此,在本研究中,我們以fascin-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)為實驗的內(nèi)對照。在上皮組織中fascin-1蛋白表達(dá)陽性率為6.3%(5/80)
6、,在正常的宮頸、卵巢、胰腺、胃、喉、肝、大腸、乳腺、均低表達(dá)或不表達(dá)fascin-1。在食管鱗狀上皮細(xì)胞,fascin-1蛋白在細(xì)胞的基底層低表達(dá),在上層不表達(dá),在鼻咽柱狀上皮,fascin-1蛋白在儲備層低表達(dá),在上層不表達(dá),這提示fascin-1蛋白可能與上皮細(xì)胞的分化程度有關(guān)系。 fascin-1蛋白在人類上皮性腫瘤中表達(dá)陽性率為59.1%(179/303)。除原發(fā)性肝癌和肺癌外,人類大部分上皮性腫瘤高表達(dá)fascin-1
7、蛋白,且明顯強于其相應(yīng)的正常組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。如fascin-1在90.9%的宮頸癌、81.6%的食管癌、79.3%的喉癌、70.8%的鼻咽癌等腫瘤中均高表達(dá)。在胃癌、鼻咽癌組織中,fascin-1蛋白表達(dá)在腫瘤的外層染色強于腫瘤的中間部分,這提示fascin-1可能與腫瘤的侵襲有關(guān)系。 2.fascin-1蛋白在人上皮性腫瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義 在194例鼻咽癌患者中,I期患者為25例(13%),II期為61
8、例(31%),III期為50例(26%),IV期為58例(30%)。194例患者中,72例(37%)發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,16例(8%)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移?;颊叩闹形荒挲g為47歲(24~70歲),其中有90例(46%)患者小于等于45歲,104例(54%)患者大于45歲;149例(77%)患者為男性,45(23%)患者為女性;中位隨訪時間為43.8(1.8~98.8)月,其中30例(15%)患者死亡。 在33例鼻咽慢性炎癥組織中,fasci
9、n-1表達(dá)陰性為21例(64%),弱陽性(+)為6例(18%),陽性為6例(18%)。在陽性表達(dá)的組織中,fascin-1主要表達(dá)在基底層。 194例鼻咽癌組織,178例成功進(jìn)行了IHC檢測,有16例組織標(biāo)本損壞無法進(jìn)行IHC檢測。在178例鼻咽癌組織中,154例(86.5%)陽性表達(dá)。在鼻咽癌組織中,fascin-1強陽性表達(dá)于侵襲的邊緣地區(qū),而在腫瘤的內(nèi)部呈弱陽性表達(dá)。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,晚期鼻咽癌患者(III和IV期)fas
10、cin-1的表達(dá)水平高于早期的鼻咽癌患者(I和II期)(P<0.05)。fascin-1表達(dá)與鼻咽癌分期(P=0.003)和T分期(P=0.014)相關(guān),而與患者的年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移不相關(guān)。 Kaplan-Meier生存分析統(tǒng)計結(jié)果顯示,fascin-1表達(dá)與鼻咽癌患者存活率呈負(fù)相關(guān)(P=0.001),即fascin-1過表達(dá)預(yù)示患者預(yù)后不良。在fascin-1強陽性(+++)患者中,5年生存率為52%,而陰性、弱
11、陽性(+)及陽性(++)患者5年生存率在78~82%。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也與鼻咽癌患者的預(yù)后相關(guān),例如N0~2的鼻咽癌患者的5年生存率高于N3的患者(P<0.001),無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者5年生存率高于發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者(P<0.001)。 在115例未發(fā)生轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者(N0和M0)中,我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),fascin-1表達(dá)仍然與患者的預(yù)后不良相關(guān)(P=0.015)。Cox回歸單因素分析結(jié)果顯示,fascin-1與預(yù)后相關(guān)(ha
12、zardsratio(HR)=1.90,P=0.004,95%CI1.23-2.94),鼻咽癌的分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也與預(yù)后相關(guān)。利用兩因素Cox回歸模型發(fā)現(xiàn),fascin-1表達(dá)是一個獨立的預(yù)后因素。利用多因素Cox回歸模型,鼻咽癌的分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是獨立的預(yù)后因素,而fascin-1不是獨立的預(yù)后因素(P=0.1),但是,在早期鼻咽癌患者中,fascin-1是一個獨立的預(yù)后因素(P=0.043,HR6.06)。
13、3.fascin-1表達(dá)沉默對鼻咽癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響 構(gòu)建了3個干擾fascin-1基因表達(dá)的慢病毒干擾載體,fascin-1干擾載體#2和#3都有明顯的干擾效果,尤其#3靶點在不同濃度的RNAi實驗中,均能夠穩(wěn)定敲減目的基因。用293FT細(xì)胞包裝fascin-1干擾載體#3和空載體,用慢病毒感染鼻咽癌細(xì)胞株5-8F和CNE1細(xì)胞,感染后48h檢測干擾效果,Westernblot實驗結(jié)果顯示,fascin-1干擾載體#3可以有
14、效的沉默鼻咽癌細(xì)胞株fascin-1蛋白的表達(dá)。 通過MTT法,我們檢測了fascin-1對鼻咽癌細(xì)胞體外增殖能力的影響,結(jié)果表明,通過6天的比較,5-8F/mock和5-8F/KD兩組細(xì)胞、CNE1/mock和CNE1/KD兩組細(xì)胞間增殖能力沒有差異(P>0.05)。平板克隆形成實驗結(jié)果也顯示5-8F/mock和5-8F/KD兩組細(xì)胞(t=-0.397,P>0.05)、CNE1/mock和CNE1/KD(t=-0.487,P>
15、0.05)兩組細(xì)胞間增殖沒有差異。這些結(jié)果均說明fascin-1對鼻咽癌的細(xì)胞體外增殖能力沒有影響。 在細(xì)胞劃痕后,5-8F/mock和5-8F/KD細(xì)胞在無血清培養(yǎng)的條件下進(jìn)行劃痕愈合實驗。實驗結(jié)果顯示,5-8F/mock細(xì)胞的遷移距離為541.00±52.85μm,5-8F/KD細(xì)胞的遷移距離為333.33±46.46μm,5-8F/KD細(xì)胞的遷移距離低于對照組,差異具有顯著性(t=5.112,P<0.01)。結(jié)果表明,fa
16、scin-1表達(dá)沉默后,細(xì)胞的運動能力降低。 腫瘤細(xì)胞侵襲24h后,5-8F/mock和5-8F/KD細(xì)胞細(xì)胞均穿透基底膜向下侵襲,在聚碳酸酯膜上可見腫瘤細(xì)胞變形的形態(tài),5-8F/mock和5-8F/KD細(xì)胞侵襲能力是不同,5-8F/mock細(xì)胞侵襲數(shù)為88.6±9.2,5-8F/KD細(xì)胞侵襲數(shù)為61.4±9.4,差異具有顯著性(t=4.623,P<0.01),結(jié)果說明fascin-1基因表達(dá)沉默后降低了鼻咽癌細(xì)胞的侵襲能力。
17、 將5-8F/mock和5-8F/KD細(xì)胞培養(yǎng)在不同的細(xì)胞外基質(zhì)中,尤其是FN中,5-8F/mock細(xì)胞形成了細(xì)胞膜皺褶,在CoIV形成絲狀偽足,而在fascin-1表達(dá)沉默的5-8F/KD細(xì)胞則很少有膜皺褶和絲狀偽足形成。實驗結(jié)果表明,fascin-1表達(dá)沉默后抑制細(xì)胞膜皺褶和偽足的形成。 結(jié)論: 1.fascin-1在正常上皮中呈低/不表達(dá)狀態(tài),在上皮性腫瘤中,fascin-1明顯表達(dá)上調(diào); 2.在鼻咽
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