利用RNAi阻抑Bax inhibitor-1（bi-1）基因表達(dá)并誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、【目的】 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國(guó)華南地區(qū)的高發(fā)性惡性腫瘤，研究表明其發(fā)病除與EB病毒感染、化學(xué)致癌物有關(guān)外，與遺傳易感基因也有密切的關(guān)系。近年來(lái)，RNA干擾(RNA interference,RNAi)的研究進(jìn)展非常迅速，這項(xiàng)技術(shù)極有可能用于腫瘤臨床治療。本課題擬從基因治療的角度，以進(jìn)化保守的凋亡抑制基因bi-1為靶點(diǎn)，針對(duì)bi-1基因設(shè)計(jì)并構(gòu)建表達(dá)shRNA的質(zhì)粒載體，利用Li

2、pofectaminea<'TM>2000(Lip)有效地將其轉(zhuǎn)染至鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)序列特異性的基因沉默，旨在研究RNAi效應(yīng)對(duì)人鼻咽癌低分化細(xì)胞株CNE-2Z和高分化細(xì)胞株CNE-1 bi-1基因表達(dá)的抑制作用及其對(duì)細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，探討鼻咽癌新的治療策略。 【方法】 根據(jù)人bi-1基因序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)特征，借助網(wǎng)上siRNA設(shè)計(jì)工具，尋找bi-1基因編碼序列(CDS)中4個(gè)可能的干擾位點(diǎn)(長(zhǎng)度為27nt)，

3、經(jīng)BLAST確定與其它基因不存在同源性。人工合成5對(duì)正反義脫氧寡核苷酸鏈，退火、定向克隆入含小鼠U6(mU6)啟動(dòng)子的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pmU6中，構(gòu)建表達(dá)shRNA的系列重組質(zhì)粒載體，研究其產(chǎn)生的shRNA抑制bi-1基因表達(dá)的效果，并觀察其誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的情況。瓊脂糖凝膠電泳法初步篩選正確的重組克隆，DNA測(cè)序驗(yàn)證重組克隆的正確性；流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)轉(zhuǎn)染率；MTT 法觀察質(zhì)粒載體及轉(zhuǎn)染試劑對(duì)CNE-2Z 和 CNE-1 生長(zhǎng)

4、增殖的影響；FCM 檢測(cè)細(xì)胞凋亡；RT-PCR法分析表達(dá)shRNA重組質(zhì)粒載體對(duì)bi-1基因mRNA表達(dá)的抑制效應(yīng)，通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)從4條27nt siRNA 候選序列中篩選出1條活性高、特異性強(qiáng)的序列。以篩選出的27nt siRNA序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的19、23、29nt siRNA序列，構(gòu)建相應(yīng)的重組質(zhì)粒并進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。MTT 法檢測(cè)重組質(zhì)粒載體對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制效應(yīng)；Hoechst33258/PI 雙染色熒光顯微鏡觀察

5、鼻咽癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化；FCM和DNA ladder檢測(cè)細(xì)胞凋亡；RT-PCR、Westem-blot分析重組質(zhì)粒載體對(duì)有關(guān)基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制效果 【結(jié)果】 DNA測(cè)序結(jié)果證實(shí)各重組質(zhì)粒(含 27nt siRNA)的插入轉(zhuǎn)錄模板完全正確。Lip 對(duì)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染率為 50％～60％。分別轉(zhuǎn)染5種含 27nt siRNA 的重組質(zhì)粒后，CNE-2Z和CNE-1 細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力降低；bi-1，mRNA 水平有不同

6、程度的下調(diào)；凋亡細(xì)胞有所增加。與其它重組質(zhì)粒比較，pmU6-bi-1-4 質(zhì)粒的干擾效果顯著，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 與pmU6-bi1-19和pmU6-bi-1-23重組質(zhì)粒相比，pmU6-bi-1-29和pmU6-bi-1-27質(zhì)粒在抑制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和誘導(dǎo)凋亡等方面效果明顯，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。轉(zhuǎn)染 pmU6-bi-1-29重組質(zhì)粒48h后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)部分鼻咽癌細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)

7、變化；DNA 凝膠電泳圖譜出現(xiàn)“梯狀”條帶；可明顯下調(diào)bi-1、bel-2、bcl-xL、survivin的mRNA和蛋白表達(dá)水平；面caspase-3、-12的mRNA水平上調(diào)，蛋白水平下調(diào)：未處理組細(xì)胞中上述基因的mRNA和蛋白水平均無(wú)明顯變化。 【結(jié)論】 成功構(gòu)建了針對(duì)人bi-1基因的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒。構(gòu)建的重組質(zhì)粒能特異、有效地阻抑bi-1基因表達(dá)，但其不能使bi-1基因完全沉默，且不同的siRNA序列下調(diào)

8、bi-1基因表達(dá)的效率不同：比較具有相同長(zhǎng)度的siRNA序列，位于基因尾部的位點(diǎn)干擾效果較好；針對(duì)同一位點(diǎn)設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的siRNA序列，當(dāng)長(zhǎng)度<30nt 時(shí)，較長(zhǎng)的siRNA序列具有較好的干擾效果。表達(dá)針對(duì)bi-1 shRNA的重組質(zhì)?？娠@著下調(diào)bi-1基因mRNA和蛋白表達(dá)水平并可誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞凋亡。在阻抑bi-1基因表達(dá)，誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，bel-2、bel-xL、survivin、caspase-3、-12的表達(dá)也發(fā)