癌基因Bmi-1誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞中心體擴(kuò)增及其機(jī)制的研究.pdf

1、背景： Bmi-1(B-cell—specificmoloneyleukemiavirusinsertsite1，B細(xì)胞特異性莫洛尼氏白血病病毒插入位點(diǎn)1)基因，屬于多梳基因(Polycombgroup，PcG)家族成員，1991年在鼠淋巴瘤中被發(fā)現(xiàn)。人Bmi-1基因定位于10號染色體短臂13區(qū)(該區(qū)域被認(rèn)為與各種白血病染色體易位有關(guān))，其DNA大小為4.9kb，mRNA為3199bp，含10個外顯子，編碼含326個氨基酸的蛋白

2、質(zhì)，分子量為36.9KD。BMI-1蛋白的氨基端為指環(huán)結(jié)構(gòu)域，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用；中間部分為螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋-轉(zhuǎn)角(helixturnhelixturn，H—T—H—T)結(jié)構(gòu)，是DNA結(jié)合域，并與轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)：羧基端為PEST序列，與Bmi-1在細(xì)胞內(nèi)快速降解有關(guān)。 癌基因Bmi-1與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，在多種腫瘤中均呈現(xiàn)高表達(dá)，如非小細(xì)胞性肺癌、結(jié)腸癌、鼻咽癌等。Bmi-1參與細(xì)胞周期、干細(xì)胞增殖、分化與衰老的調(diào)控，也可以誘導(dǎo)細(xì)

3、胞的早期轉(zhuǎn)化。 在哺乳動物細(xì)胞中，中心體由一對中心粒及其包繞在周圍的大量其它功能蛋白質(zhì)組成，每一次細(xì)胞分裂都伴隨著一次中心體的復(fù)制和分裂。中心體在細(xì)胞的有絲分裂中對細(xì)胞兩極紡錘體的形成起重要作用。在細(xì)胞分裂過程中，中心粒的正常復(fù)制對于細(xì)胞染色體的正確分裂起關(guān)鍵作用，其活動與細(xì)胞分裂、激活及復(fù)制密切相關(guān)。中心體的復(fù)制周期與細(xì)胞的分裂周期有密切聯(lián)系而且與其相吻合，假如中心體的復(fù)制周期不能緊密與細(xì)胞分裂周期相吻合，則產(chǎn)生兩個以上的中心

4、體，出現(xiàn)中心體擴(kuò)增，這種現(xiàn)象常發(fā)生在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞及不同分期的腫瘤組織中。 我們的前期研究證實(shí)Bmi-1可在乳腺癌細(xì)胞系中引起中心體擴(kuò)增，但是其誘導(dǎo)中心體擴(kuò)增的可能機(jī)制目前尚不清楚。本課題將進(jìn)一步探討B(tài)mi-1對鼻咽癌細(xì)胞中心體復(fù)制調(diào)控的作用，并對其可能的機(jī)制進(jìn)行初步研究。 研究目的： 研究Bmi—l對鼻咽癌細(xì)胞株中心體復(fù)制的調(diào)控作用，并探討其可能的分子機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng)

5、 本實(shí)驗(yàn)所用的鼻咽癌細(xì)胞6—10B及CNE2均用含10％的FBS的1640培養(yǎng)。 2.載體 分別構(gòu)建高表達(dá)Bmi-1載體pMSCV/Bmi-1及含有Bmi-1-RNAi的pSuper-retro—BMI-RNAi(s)。 3.WesternBlot細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，聚丙烯酰胺分離，并將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，抗體孵育，膠片顯影。 4.逆轉(zhuǎn)錄PCR用Trizol提取細(xì)胞的總RNA

6、，定量之后取2ug做逆轉(zhuǎn)錄PCR。 5.免疫熒光染色對異常復(fù)制的中心體進(jìn)行計(jì)數(shù)，并對相關(guān)的分子進(jìn)行定位及定量。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.01(雙側(cè)檢驗(yàn))認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.成功建立了穩(wěn)定高表達(dá)Bmi-1的細(xì)胞株6-10B/Bmi-1及Bmi-1-RNAi穩(wěn)定起作用的細(xì)胞株CNE2/Bmi-1-RNAi用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法成功建立穩(wěn)定外源性高表達(dá)Bmi-1的

7、鼻咽癌上皮細(xì)胞株6-10B/Bmi-1；用同樣的方法成功建立了Bmi-1-RNAi穩(wěn)定起作用的鼻咽癌細(xì)胞株CNE2/Bmi-1-RNAi。嘌呤霉素篩選3天后，連續(xù)傳代，檢測第7代細(xì)胞中mRNA和蛋白水平Bmi-1的表達(dá)量，結(jié)果證實(shí)穩(wěn)定細(xì)胞株的成功建立。 2.Bmi-1能誘導(dǎo)中心體的擴(kuò)增在穩(wěn)定高表達(dá)外源性Bmi-1以及Bmi-1-RNAi穩(wěn)定起作用的的鼻咽癌細(xì)胞中采用免疫熒光染色的方法，計(jì)數(shù)各組細(xì)胞中出現(xiàn)中心體異常復(fù)制的個數(shù)，并進(jìn)

8、行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與空質(zhì)粒相比較，發(fā)現(xiàn)外源性高表達(dá)Bmi-1的細(xì)胞中心體出現(xiàn)更多的異常復(fù)制，而Bmi-1-RNAi的細(xì)胞中心體異常復(fù)制的個數(shù)減少，兩組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3.Bmi-1通過激活A(yù)KT通路引起中心體擴(kuò)增用免疫熒光染色及westernblot等方法對AKT信號通路及cyclinD1-P27分子進(jìn)行定位及定量，發(fā)現(xiàn)Bmi-1能激活A(yù)KT及GSK，并能使β-catenin發(fā)生定位改變，從胞膜上轉(zhuǎn)位至胞核，上調(diào)cyclinD1的