hTERT-CMV增強(qiáng)型表達(dá)載體調(diào)控TK基因靶向殺傷鼻咽癌的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：
　　 探討經(jīng)改良構(gòu)建的hTERT/CMV增強(qiáng)型表達(dá)載體pGL3-basic-EGFP-TK-hTERTp-CMV enhancer調(diào)控TK基因靶向殺滅鼻咽癌細(xì)胞及其裸鼠移植瘤的作用效應(yīng)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 1.細(xì)胞系:人鼻咽癌細(xì)胞5-8F、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7及人臍靜脈細(xì)胞ECV-304均由南方醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室惠贈(zèng)。常規(guī)培養(yǎng)。裸鼠:健康4～5周齡的SPF 級(jí)BALB/ c nu/nu裸鼠

2、,體重18～22g,雌雄不限,購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
　　 2.增強(qiáng)型質(zhì)粒載體及構(gòu)建:pGL3-basic-EGFP-TK-hTERTp-CMV enhancer、pGL3-basic-EGFP-TK-hTERTp、pGL3-basic-EGFP質(zhì)粒載體均為本課題組構(gòu)建。對(duì)NCBI上已經(jīng)提交的TK基因序列(NCBI登錄號(hào)為AY575228)進(jìn)行分析,結(jié)果:TK基因可通過(guò)Xho Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)插入,同時(shí)在設(shè)計(jì)引物

3、的時(shí)候去除終止子TGA,使TK基因與EGFP基因融合。以pGL3-Basic空載體為骨架,通過(guò)選擇的合適的酶切分別連入hTERT基因的核心啟動(dòng)子區(qū)(278bp),TK目的基因(1131bp)及人CMV增強(qiáng)子(406bp),同時(shí)為了檢測(cè)方便可將pGL3-Basic載體上的luc基因(熒光素酶)換成EGFP基因(綠色熒光蛋白),從而獲得增強(qiáng)型表達(dá)載體pGL3-basic-EGFP-TK-hTERTp-CMV enhancer及對(duì)照組載體pG

4、L3-basic-EGFP-TK-hTERTp、pGL3-basic-EGFP。
　　 3.TK基因綠色熒光蛋白表達(dá)分析
　　 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞5-8F及對(duì)照組細(xì)胞MCF-7、ECV-304(1×106/孔)接種到六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每種細(xì)胞兩孔,12小時(shí)后(密度約為80％)采用Lip2000分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGL3-basic-EGFP-TK-hTERTp-CMV enhancer 及pGL3-basic-EGFP-TK-

5、hTERTp,每孔的DNA用量、細(xì)胞數(shù)均保持一致。具體轉(zhuǎn)染方法參照其說(shuō)明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24h后,在熒光顯微鏡下直接觀察TK基因綠色熒光蛋白量的表達(dá)差異。
　　 4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染pGL3-basic-EGFP-TK-hTERTp-CMVenhancer、pGL3-basic-EGFP-TK-hTERTp及pGL3-basic-EGFP后TK基因mRNA的表達(dá)水平。
　　 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后TRIZOL抽提總R

6、 N A,取4μl RNA模板做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),熒光定量PCR檢測(cè)檢測(cè)T K基因的存在和表達(dá)情況。所用上游引物:5'-AGCAAGAAG CCACGGAAG TC-3’,下游引物:5’-AGT TGC GTG GTG GTG GTTTT-3',H-β-actin上游引物:5'-GCATGG GTC AGAAGG ATT CCT-3',下游引物:5'-TCG TCC CAG TTG GTG ACG AT-3'。依據(jù)方法計(jì)算各組A值。
　

7、　 5.端粒酶活性檢測(cè)
　　 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞5-8F(1×106/孔)接種到六孔培養(yǎng)板中,共三孔(1、2、3),12小時(shí)后,1、2孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGL3-basic-EGFP-TK-hTERTp-CMV enhancer,12小時(shí)后1中加入前體藥物GCV,終濃度為10 ug/mL,48小時(shí)后采用Stretch PCR法對(duì)三孔細(xì)胞5-8F進(jìn)行端粒酶檢測(cè),比較轉(zhuǎn)染前后腫瘤細(xì)胞端粒酶活性的改變。同時(shí)檢測(cè)正常對(duì)照細(xì)胞ECV-304的端

8、粒酶活性。具體方法參照其試劑盒說(shuō)明書操作。
　　 6.MTT及Boyden小室實(shí)驗(yàn)
　　 為檢測(cè)增強(qiáng)型載體體外殺傷腫瘤的效果及對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲力的抑制作用,將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞5-8F及MCF-7(1×105/孔)接種N96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,12小時(shí)后分別轉(zhuǎn)染5-8F細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞(陽(yáng)性對(duì)照),每種細(xì)胞共設(shè)立五個(gè)組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組1(空白對(duì)照)細(xì)胞不做任何干預(yù)措施；對(duì)照組
　　 2 轉(zhuǎn)染pGL3

9、-basic-EGFP載體后,加入前體藥物GCV；對(duì)照組3轉(zhuǎn)染pGL3-basic-EGFP-TK-hTERTp-CMV enhancer,不加前體藥物GCV；對(duì)照組4轉(zhuǎn)染單啟動(dòng)子組載體pGL3-basic-EGFP-TK-hTERTp加前體藥物GCV；實(shí)驗(yàn)組5中轉(zhuǎn)染pGL3-basic-EGFP-TK-hTERTp-CMV enhancer加前體藥物GCV。轉(zhuǎn)染12 h后,對(duì)照組2、對(duì)照組4、實(shí)驗(yàn)組5中加入GCV,終濃度為10 ug/

10、mL,72小時(shí)后進(jìn)行M TT實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)孔O D值/對(duì)照孔O D值×100％,最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以相對(duì)細(xì)胞存活率反映,即設(shè)定對(duì)照組1的細(xì)胞存活率為100％,得出其他組的相對(duì)存活率。采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　 以4℃的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel至終濃度0.8 g/L,每個(gè)Boyden小室約為100 μl,分3次涂在Transwell的聚碳酸酯膜上,4℃風(fēng)干。取實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染增強(qiáng)型載體加GCV(終濃度為10

11、 μg/ml)預(yù)處理48 h后的5-8F細(xì)胞和對(duì)照組(未做任何處理)5-8F細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度,按細(xì)胞數(shù)1×105/200 μl加入上室,下室加入含10％小牛血清的RPMI 1640培基500 μl,37℃孵育24 h。用棉簽仔細(xì)擦凈膜上未侵襲的細(xì)胞以及人工基底膜膠,下室面用甲醇固定10 min后結(jié)晶紫染色,在顯微鏡下每張膜任意觀察5個(gè)視野,每組設(shè)3個(gè)平行樣本。400倍顯微鏡視野下的穿膜細(xì)胞數(shù),取其平均值,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　

12、 7.體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)
　　 裸鼠30只,飼養(yǎng)于SPF級(jí)無(wú)菌飼養(yǎng)室,自由攝取食物和水,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼻咽癌細(xì)胞5-8F,制成單細(xì)胞懸液,裸鼠左側(cè)腋部皮下植入5×106(0.2mL)5-8F細(xì)胞。接種后第10d,當(dāng)絕大多數(shù)腫瘤直徑達(dá)1.2～1.5cm時(shí),將荷瘤裸鼠隨機(jī)分成6個(gè)組:①空白對(duì)照組:不作任何干預(yù)措施；②陰性對(duì)照組1:腹腔注射GCV；③陰性對(duì)照組2:瘤內(nèi)注射脂質(zhì)體,腹腔注射GCV；④陰性對(duì)照組3:瘤內(nèi)注射增強(qiáng)型載體-脂質(zhì)體；

13、⑤陽(yáng)性對(duì)照組:瘤內(nèi)注射單啟動(dòng)子載體-脂質(zhì)體,腹腔注射GCV；⑥實(shí)驗(yàn)組:瘤內(nèi)注射增強(qiáng)型載體-脂質(zhì)體,腹腔注射GCV。用25ul脂質(zhì)體Lip2000包裹10ug質(zhì)粒重組體(增強(qiáng)型載體,單啟動(dòng)子載體)瘤內(nèi)注射,分別在第1次注射質(zhì)粒后的第4、7、10、14天,瘤體局部注射質(zhì)粒1次,第1次質(zhì)粒瘤內(nèi)注射后次日,每只裸鼠腹腔注射GCV(100mg/kg),隔日一次,共12次。觀察6組移植瘤的生長(zhǎng)情況,待空白組的腫瘤體積達(dá)到約6m2時(shí),停止實(shí)驗(yàn),觀察不

14、同處理組對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
　　 移植瘤瘤塊質(zhì)量檢測(cè):治療結(jié)束后,斷頸處死動(dòng)物,完整剝離腫瘤,稱重,根據(jù)如下公式計(jì)算各組抑瘤率:抑瘤率(％)=(空白組瘤塊質(zhì)量-治療組瘤塊質(zhì)量)/空白組瘤塊質(zhì)量×100％。
　　 腫瘤細(xì)胞接種裸鼠后第40天結(jié)束實(shí)驗(yàn),處死裸鼠,取實(shí)驗(yàn)組肝臟及腎臟組織,經(jīng)10％的甲醛液固定,進(jìn)行病理學(xué)檢查。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表

15、示,顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析、兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論
　　 1、以hTERT啟動(dòng)子及CMV增強(qiáng)子介導(dǎo)TK基因的增強(qiáng)型表達(dá)載體能夠靶向殺滅鼻咽癌細(xì)胞及裸鼠移植瘤,且作用明顯強(qiáng)于單啟動(dòng)子載體組,其增強(qiáng)TK基因活性是單啟動(dòng)子載體的2-5倍,體內(nèi)應(yīng)用對(duì)裸鼠肝腎功能無(wú)明顯損害作用。這種新型高效、靶向增強(qiáng)型載體有可能成為一種鼻咽癌臨床靶向基因治療的新策略。
　　 2、增強(qiáng)型TK基