靶向PCNA基因的siRNA和shRNA抑制膀胱癌生長的體內(nèi)外實驗研究.pdf

1、膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，手術(shù)治療后仍有較高的復(fù)發(fā)率?，F(xiàn)階段，如何有效地治療膀胱癌并預(yù)防復(fù)發(fā)依然是基礎(chǔ)和臨床研究的重點和難點問題。RNA干擾現(xiàn)象被認(rèn)識已有10年左右時間，但到目前為止，未發(fā)現(xiàn)哺乳動物有內(nèi)源表達(dá)的小干擾RNA(siRNA)。一些研究者采用體外化學(xué)合成的方法獲得siRNA來進(jìn)行腫瘤治療的研究，siRNA在細(xì)胞內(nèi)作用時間較為短暫，適用于研究瞬時效應(yīng)，不宜用來長期觀察RNA干擾后細(xì)胞生物學(xué)功能的變化。能夠表達(dá)短發(fā)夾結(jié)構(gòu)R

2、NA(shRNA)的真核表達(dá)質(zhì)粒可以克服siRNA作用時間短暫的缺點，研究者通過脂質(zhì)體等輔助轉(zhuǎn)染方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)長時間表達(dá)shRNA，短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA在細(xì)胞漿內(nèi)被Dicer酶切割加工成siRNA后發(fā)揮RNA干擾作用。近年來，RNA干擾技術(shù)為研究膀胱癌提供了一個全新的途徑。 惡性增殖是癌細(xì)胞的主要特征之一，長期以來，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)僅僅是用來判定包括膀胱癌在內(nèi)的許多腫瘤惡性增殖程度和不良預(yù)后的標(biāo)志物

3、，很少有研究者將PCNA直接與惡性腫瘤的治療聯(lián)系在一起，將PCNA基因作為小干擾RNA治療膀胱癌的靶基因國內(nèi)外文獻(xiàn)未見有報道。本課題設(shè)計思路：首先，體外化學(xué)合成siRNA，通過脂質(zhì)體包裹后轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞，研究siRNA瞬時mRNA干擾效果以及對膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，再根據(jù)siRNA的序列構(gòu)建shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒載體，進(jìn)一步研究shRNA表達(dá)質(zhì)粒持久mRNA干擾效果以及對膀胱癌生長的影響，旨在通過檢測靶向PCNA基因的siRNA(

4、PCNA-siRNA)和shRNA(PCNA-shRNA)在體內(nèi)外抑制膀胱癌生長的效果為治療膀胱癌并預(yù)防復(fù)發(fā)作出一些積極有益的探索。 第一部分：靶向PCNA基因的有效siRNA序列的篩選 目的：設(shè)計并篩選出靶向PCNA基因的有效siRNA序列，為后續(xù)研究提供依據(jù)。 方法：針對人類PCNA基因mRNA(NM-002592)序列設(shè)計并化學(xué)合成三條siRNA。選擇100nM作為siRNA的最佳終濃度，在siRNA轉(zhuǎn)染后

5、24、48、72和96小時用熒光定量RT-PCR(RTq-PCR)檢測T24細(xì)胞PCNA-mRNA表達(dá)水平的變化；在siRNA轉(zhuǎn)染后72小時用western-blotting檢測T24細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)水平的變化。 結(jié)果：3條PCNA-siRNA在轉(zhuǎn)染后48小時干擾效果最好，mRNA抑制率均在80％以上，其中PCNA-siRNA3抑制效果最好，mRNA抑制率高達(dá)90.2±1.7％。PCNA蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)水平的變化趨勢一

6、致。 結(jié)論：PCNA-siRNA1(靶位點291-309)、PCNA-siRNA2(靶位點550-568)和PCNA-siRNA3(靶位點679-697)均為有效序列。PCNA-siRNA3干擾效果最好。 第二部分：靶向PCNA基因的siRNA抑制膀胱癌生長的體外實驗研究 目的：探討PCNA基因表達(dá)瞬時抑制后T24細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。 方法：選擇干擾效果最好的PCNA-siRNA3來抑制膀胱癌T24細(xì)胞

7、PCNA基因的表達(dá)，在PCNA基因表達(dá)抑制后用MTT檢測T24細(xì)胞生長抑制率，DAPI染色檢測T24細(xì)胞凋亡，F(xiàn)CM檢測T24細(xì)胞周期和凋亡，Transwell體外侵襲實驗檢測T24細(xì)胞體外侵襲能力。 結(jié)果：在轉(zhuǎn)染后第1、2、3、4、5天T24細(xì)胞生長抑制率，干擾組分別為23.7±2.8％、70.8±0.7％、69.8±0.4％、48.8±0.3％、31.7±0.2％，陰性對照組分別為2.4±0.9％、3.9±0.1％、5.8±

8、0.6％、12.2±0.4％、8.1±0.1％，干擾組T24細(xì)胞生長抑制率明顯高于陰性對照組，以第2、3天效果最佳；在轉(zhuǎn)染后第3天，干擾組多數(shù)視野可見少量的凋亡細(xì)胞，而空白對照組、陰性對照組視野內(nèi)幾乎看不到凋亡細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測干擾組細(xì)胞凋亡率為7.4±0.6％，較空白對照組和陰性對照組明顯增加，干擾組有更多的細(xì)胞被阻滯在S期和G1期；在轉(zhuǎn)染后第3天，Transwell體外侵襲實驗顯示：空白對照組、陰性對照組、干擾組穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)分

9、別為95±7、90±8和為20±2。干擾組穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)較空白對照組和陰性對照組少。 結(jié)論：PCNA-siRNA3有效地抑制了T24細(xì)胞增殖，在轉(zhuǎn)染后第2、3天抑制能力最強：在轉(zhuǎn)染后第3天，PCNA-siRNA3促進(jìn)了T24細(xì)胞凋亡并有效地抑制了T24細(xì)胞體外侵襲能力，干擾組有更多的細(xì)胞被阻滯在S期和G1期。 第三部分：靶向PCNA基因的有效shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定和篩選 目的：構(gòu)建靶向PCNA基因的

10、有效shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒，為體內(nèi)研究提供依據(jù)。 方法：根據(jù)PCNA-siRNA1～3序列構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-PCNA-shRNA1～3真核表達(dá)質(zhì)粒。質(zhì)粒啟動子為U6，含抗性篩選標(biāo)記Neomycin同時可以表達(dá)綠色熒光蛋白。所得質(zhì)粒用BamH I，Pst I分別酶切鑒定。委托上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序鑒定。通過G418篩選提高T24細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，篩選后2周后獲得多克隆T24細(xì)胞，用熒光定量RT-PCR(RT

11、q-PCR)檢測多克隆T24細(xì)胞PCNA-mRNA表達(dá)，用western-blotting檢測多克隆T24細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)，選定有效shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒。 結(jié)果：pGPU6/GFP/Neo-PCNA-shRNA1～3真核表達(dá)質(zhì)粒均為陽性重組載體且測序正確。篩選2周后質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率>50％。T24-PCNA-shRNA3多克隆細(xì)胞PCNA-mRNA的表達(dá)抑制率達(dá)47.0±1.9％，明顯高于陰性對照組T24-shNC多克隆細(xì)胞的

12、1.8±0.7％。(p<0.05)。PCNA蛋白表達(dá)水平與mRNA表達(dá)水平的變化趨勢一致。 結(jié)論：成功構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-PCNA-shRNA1～3真核表達(dá)質(zhì)粒，pGPU6/GFP/Neo-PCNA-shRNA3持續(xù)有效地抑制了T24細(xì)胞PCNA基因的表達(dá)。 第四部分：靶向PCNA基因的shRNA抑制膀胱癌生長的體內(nèi)實驗研究 目的：探討PCNA-shRNA3真核表達(dá)質(zhì)粒在體內(nèi)抑制膀胱癌生長的情況。

13、 方法：1、在右側(cè)脅腹部建立荷人膀胱癌BALB/c裸鼠移植瘤模型。裸鼠隨機分成3組，每組6只，分別為未處理組(瘤內(nèi)未注射)、陰性對照組(瘤內(nèi)注射shNC質(zhì)粒20ug/鼠)和處理組(瘤內(nèi)注射PCNA-shRNA3質(zhì)粒20ug/鼠)。在接種T24細(xì)胞后第8、10、13、16、19、22、25天注射，共7次。于接種后第28天以斷頸法處死所有裸鼠。2、篩選PCNA-shRNA3相對穩(wěn)定表達(dá)T24多克隆細(xì)胞，在BALB/c裸鼠右側(cè)脅腹部接種P

14、CNA-shRNA3相對穩(wěn)定表達(dá)T24多克隆細(xì)胞，接種后第28天以斷頸法處死所有裸鼠。測量腫瘤體積，腫瘤組織作常規(guī)HE染色和免疫組織化學(xué)染色。 結(jié)果：1、未處理組和陰性對照組腫瘤生長較快，接種T24細(xì)胞后第28天，腫瘤表面張力大，有破潰的跡象，瘤體平均體積分別為761.3±149.9 mm3和718.3±75.1mm3，處理組腫瘤生長速度較慢，腫瘤表面無破潰的跡象，瘤體平均體積328.1±150.1mm3。未處理組和陰性對照組相

15、比差別無統(tǒng)計學(xué)意義，處理組與未處理組、陰性對照組相比差別均具有統(tǒng)計學(xué)意義。2、多克隆細(xì)胞組接種后第28天，4只裸鼠有肉眼可見腫瘤，最大直徑約4mm，2只未出瘤。4只裸鼠瘤體平均體積為6.8±1.6mm3，較未處理組明顯小。3、PCNA蛋白表達(dá)從強到弱依次為：未處理組與陰性對照組、處理組、多克隆細(xì)胞組。 結(jié)論：1、PCNA-shRNA3真核表達(dá)質(zhì)粒持續(xù)有效地抑制了T24細(xì)胞皮下成瘤能力。2、PCNA-shRNA3真核表達(dá)質(zhì)粒有效抑