PLCε特異性shRNA對(duì)人膀胱癌BIU-87細(xì)胞增殖效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分：PLCε特異性shRNA對(duì)人膀胱癌BIU-87細(xì)胞體外增殖效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：探討PLCε特異性shRNA對(duì)人膀胱癌BIU-87細(xì)胞體外增殖效應(yīng)的影響。
　　 方法：通過(guò)真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將pGenesil-PLCε重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BIU-87細(xì)胞，并同時(shí)設(shè)轉(zhuǎn)染pGenesil-NP重組質(zhì)粒細(xì)胞和轉(zhuǎn)染生理鹽水細(xì)胞分別作為陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，G418篩選陽(yáng)性克隆細(xì)胞，單克隆挑選，擴(kuò)大培養(yǎng)，RT-PCR及We

2、stern blot法檢測(cè)PLCε mRNA和蛋白表達(dá)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的改變，流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞的周期分布。
　　 結(jié)果：獲得穩(wěn)定表達(dá)PLCε-shRNA的陽(yáng)性克隆BIU-87細(xì)胞，克隆細(xì)胞PLCε mRNA和蛋白表達(dá)抑制率為46.65％和35.68％，G0/G1期細(xì)胞增多，G2/M期細(xì)胞減少，細(xì)胞增殖受到明顯抑制。
　　 結(jié)論：pGenesil-PLCε重組質(zhì)粒可有效沉默BIU-87細(xì)胞PLCεmRNA和蛋白

3、表達(dá)，并使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，延緩細(xì)胞生長(zhǎng)，從而抑制細(xì)胞增殖。
　　 第二部分：PLCε特異性shRNA對(duì)人膀胱癌BIU-87細(xì)胞體內(nèi)增殖效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：探討PLCε特異性shRNA對(duì)人膀胱癌BIU-87細(xì)胞體內(nèi)增殖效應(yīng)的影響，并研究其相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：將第一部分獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別接種于裸鼠皮下建立人膀胱癌裸鼠移植瘤模型，相對(duì)應(yīng)的分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組以及空白對(duì)照組，監(jiān)測(cè)移植瘤體積，

4、稱移植瘤重量，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)移植瘤組織cyclinD1蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)緩慢，移植瘤的體積和重量都明顯小于對(duì)照組（p<0.01），抑瘤率為71.95％，實(shí)驗(yàn)組移植瘤cyclinD1蛋白表達(dá)受到抑制。
　　 結(jié)論：PLCε基因沉默后可抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，PLCε的這些作用可能和下調(diào)cyclin D1蛋白的表達(dá)有關(guān)。
　　 第三部分：PLCε特異性shRNA對(duì)人膀胱癌BIU-87細(xì)胞裸

5、鼠移植瘤中Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)水平的影響
　　 目的：探討應(yīng)用短發(fā)夾RNA干擾技術(shù)沉默PLCε基因?qū)θ税螂装┮浦擦錾L(zhǎng)及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響。
　　 方法：人膀胱癌BIU-87細(xì)胞種植于裸鼠皮下，待移植瘤體積達(dá)40mm3左右時(shí)，在腫瘤部位分別直接注射PLCε特異性shRNA表達(dá)質(zhì)粒、陰性對(duì)照質(zhì)粒以及0.9％氯化鈉溶液；觀察腫瘤體積的變化情況，30 d后處死全部裸鼠，取瘤組織，稱瘤質(zhì)量；瘤組織

6、制備病理切片，HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)的變化；RT-PCR鑒定瘤組織中PLCε mRNA的表達(dá)；Western印跡法檢測(cè)瘤組織中PLCε、Bcl-2、Bax、p-Akt1/Akt1和p-Bad/Bad蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：PLCε-shRNA組小鼠移植瘤生長(zhǎng)明顯緩慢，瘤組織體積和質(zhì)量均明顯小于對(duì)照組；HE染色結(jié)果顯示，瘤組織中出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、裂碎等凋亡征象；RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，PLCεmRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05）；