中國人膀胱癌BIU-87細(xì)胞系導(dǎo)向肽的體外篩選與特異性鑒定.pdf

1、目的：噬菌體展示環(huán)七肽庫體外減性篩選，獲得能與中國人膀胱癌BIU-87細(xì)胞系高度結(jié)合的小分子多肽，鑒定其與中國人膀胱癌BIU-87細(xì)胞系結(jié)合的特異性。
　　方法：采用噬菌體展示環(huán)七肽庫技術(shù)，以中國人膀胱癌BIU-87細(xì)胞系作為靶細(xì)胞，中國人膀胱粘膜上皮細(xì)胞為吸附細(xì)胞，體外差減篩選三輪后，隨機(jī)挑取25個(gè)噬菌體克隆，排除非特異性結(jié)合以及假陽性的噬菌體，ELISA鑒定其與中國人膀胱癌BIU-87細(xì)胞系的結(jié)合能力、及陽性噬菌體克隆的特異性

2、，提取特異性噬菌體的DNA進(jìn)行序列測(cè)定，并對(duì)得到的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，將待選擇的氨基酸序列進(jìn)行化學(xué)合成并標(biāo)記熒光素異硫氰酸（FITC），制備成熒光探針，通過流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡兩種方法鑒定各個(gè)探針與中國人膀胱癌BIU-87細(xì)胞系、中國人正常膀胱粘膜上皮細(xì)胞、人前列腺癌PC3M細(xì)胞系、人肝癌SMMC7721細(xì)胞系以及人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞系結(jié)合的情況。
　　結(jié)果：
　　1、體外差減篩選三輪后，噬菌體在中國人膀胱癌BI

3、U-87細(xì)胞系上出現(xiàn)明顯富集?；厥蘸笫删w的滴度由第一輪的8.8×107增加到第三輪的2.15×109，增加了約24倍；同時(shí)回收率也顯著提高，由第一輪的4.4×10-4增加至第三輪的1.1×10-2。
　　2、對(duì)篩選三輪后隨機(jī)挑取的25個(gè)藍(lán)色噬菌體單克隆進(jìn)行ELISA鑒定顯示：25個(gè)克隆中有19個(gè)為陽性克隆，陽性率76％，特異性鑒定顯示：10個(gè)為強(qiáng)陽性克?。≒＜0.05），說明這10個(gè)噬菌體克隆是與中國人膀胱腫瘤BIU-87細(xì)胞系

4、特異性結(jié)合的噬菌體克隆。
　　3、將上述10個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行DNA測(cè)序并翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列，顯示共有序列為SISSLTH、MARYMSA、TVRTSAD，經(jīng)搜索BLAST數(shù)據(jù)庫，上述氨基酸之間均無同源性，在人源性現(xiàn)有的蛋白質(zhì)/多肽庫中沒有發(fā)現(xiàn)與上述氨基酸序列完全一致或者是有良好同源性的蛋白質(zhì)分子。
　　4.流式細(xì)胞儀與熒光顯微鏡顯示：小分子熒光探針FITC-SISSLTH與中國人BIU-87細(xì)胞系的親和性強(qiáng)于FITC-M

5、ARYMSA、FITC-TVRTSAD、FITC–EDRKETAK以及FITC(P<0.05)。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：小分子熒光探針FITC-SISSLTH與中國人BIU-87細(xì)胞系的親和性要明顯高于其他三種細(xì)胞系(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)利用噬菌體展示環(huán)七肽庫技術(shù)體外篩選獲得3條能與中國人膀胱癌BIU-87細(xì)胞系特異性結(jié)合的小分子多肽SISSLTH、MARYMSA、TVRTSAD。經(jīng)BLAST數(shù)據(jù)庫搜索，未查