PinX1基因靶向端粒酶抑制鼻咽癌干細(xì)胞及其TRFs調(diào)控機制的研究.pdf

1、鼻咽癌是中國南方地區(qū)及東南亞國家高發(fā)的惡性腫瘤之一，該類腫瘤的復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致治療失敗及死亡的重要方式。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞是導(dǎo)致包括鼻咽癌在內(nèi)的惡性腫瘤復(fù)發(fā)和耐藥的重要原因，目前已從多種惡性腫瘤中分選出腫瘤干細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞表現(xiàn)出一定的自身特性，如自我復(fù)制能力強，高表達(dá)端粒酶活性，具有CD133+、CD44+表面標(biāo)志物等。這為進一步探討腫瘤干細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展及靶向腫瘤干細(xì)胞提供了新領(lǐng)域。本課題組曾開展了端粒酶抑制劑Pin

2、X1基因靶向鼻咽癌細(xì)胞端粒酶活性抑制鼻咽癌細(xì)胞的前期研究工作，在此基礎(chǔ)上，擬采用PinX1基因靶向鼻咽癌CD133+腫瘤干細(xì)胞，探討其對該腫瘤干細(xì)胞端粒酶活性下調(diào)、抑制腫瘤干細(xì)胞活性，并進一步探討端粒重復(fù)序列結(jié)合蛋白(TRF1及TRF2)的調(diào)控作用機制，闡明其在PinX1基因作用中的地位。
　　一.CD133+陽性鼻咽癌細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特征
　　目的:觀察以CD133+作為干細(xì)胞標(biāo)志物分選CD133陽性細(xì)胞的增殖、遷移等能

3、力。
　　方法:鼻咽癌CNE2細(xì)胞通過免疫磁珠分選的方法獲得CD133+細(xì)胞和CD133-細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞術(shù)對分選的效率進行驗證。然后將獲得的CD133+細(xì)胞和CD133-細(xì)胞進行干細(xì)胞球誘導(dǎo)及裸鼠體內(nèi)成瘤，通過QPCR法檢測CD133+細(xì)胞和CD133-細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物SOX2、Nanog的表達(dá)。其次用CCK-8觀察兩株細(xì)胞的生長情況，通過Transwell法和劃線法觀察細(xì)胞遷移情況，通過Transwell法觀察細(xì)胞侵襲情

4、況。
　　結(jié)果:
　　1.以未加任何標(biāo)記的CNE2細(xì)胞系為陰性對照，對常規(guī)培養(yǎng)3天的細(xì)胞表面的CD133和CD44的表達(dá)情況檢測發(fā)現(xiàn)，CD133+和CD133-細(xì)胞成功分選。
　　2.將新分選的CD133+和CD133-細(xì)胞，接種到含有bFGF、EGF、胰島素和B27無血清干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，14天后，CD133+腫瘤細(xì)胞球的半徑顯著大于CD133-細(xì)胞。
　　3.通過QPCR檢測CD133+和CD133-細(xì)胞中

5、的Nanog和SOX2，Nanog和SOX2的mRNA在CD133+細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于CD133-細(xì)胞。
　　4.使用CCK-8法考察分選的CD133+和CD133-細(xì)胞的生長情況，發(fā)現(xiàn)CD133+細(xì)胞增殖速度顯著快于CD133-細(xì)胞。
　　5.通過劃線實驗或Transwell法檢測CD133+和CD133-細(xì)胞的遷移和侵襲能力，發(fā)現(xiàn)CD133+細(xì)胞比CD133-細(xì)胞遷移、侵襲能力強。
　　6.該種CD133+鼻咽

6、癌干細(xì)胞比CD133-細(xì)胞群有較強的裸鼠成瘤能力。結(jié)論:采用CD133磁珠從鼻咽癌CNE2細(xì)胞中成功分選出CD133+鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞，同時表達(dá)Nanog和SOX2及端粒酶活性，體外成球、增殖、遷移、侵襲能力及裸鼠成瘤等腫瘤干細(xì)胞特征明顯強于CD133-鼻咽癌細(xì)胞群。
　　二.PinX1基因靶向端粒酶抑制CD133+鼻咽癌干細(xì)胞
　　目的:探討PinX1基因?qū)D133+鼻咽癌干細(xì)胞增殖和遷移等活性的影響
　　方法:在

7、CD133+細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PinX1過表達(dá)質(zhì)粒及相應(yīng)的空載質(zhì)粒，在CD133-細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PinX1siRNA及NC siRNA，將獲得細(xì)胞進行干細(xì)胞球誘導(dǎo)，用CCK-8觀察細(xì)胞的生長情況，通過Transwell法和劃線法觀察細(xì)胞遷移情況，通過Transwell法觀察細(xì)胞侵襲情況，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果:
　　1.PinX1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CD133+鼻咽癌干細(xì)胞后，能明顯下調(diào)該腫瘤干細(xì)胞端粒酶活性，
　　2.C

8、D133+細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PinX1過表達(dá)質(zhì)粒后，細(xì)胞增殖速度低于空載組;CD133-細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PinX1siRNA后生長速度高于NC對照組。
　　3.CD133+細(xì)胞轉(zhuǎn)染PinX1過表達(dá)質(zhì)粒后，干細(xì)胞球半徑顯著變小，細(xì)胞成球能力減弱;而CD133-細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA后，成球半徑略有增加，細(xì)胞成球能力略有增強。
　　4.CD133+細(xì)胞轉(zhuǎn)染PinX1過表達(dá)質(zhì)粒后，細(xì)胞遷移、侵襲比例低于空載組;CD133-細(xì)胞轉(zhuǎn)染PinX1siR

9、NA后，細(xì)胞遷移、侵襲比例高于NC組。
　　5.CD133+細(xì)胞轉(zhuǎn)染PinX1過表達(dá)質(zhì)粒后，細(xì)胞凋亡比例高于空載組;CD133-細(xì)胞轉(zhuǎn)染PinX1siRNA后，細(xì)胞凋亡比例低于NC組。
　　結(jié)論:PinX1能夠通過下調(diào)腫瘤干細(xì)胞中端粒酶活性抑制CD133+鼻咽癌干細(xì)胞的增殖和遷移、增加CD133+細(xì)胞的凋亡。
　　三.hTERT及TRFs在PinX1基因作用中的調(diào)控機制
　　目的:進一步探討hTERT及TRFs在

10、PinX1基因作用中調(diào)控作用機制
　　方法:通過QPCR檢測hTERT的表達(dá)檢測CD133+細(xì)胞中端粒酶的活性，并通過QPCR的方法檢測PinX1的表達(dá)。在CD133+細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PinX1過表達(dá)質(zhì)粒及相應(yīng)的空載質(zhì)粒，在CD133-細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PinX1siRNA及NC siRNA，通過QPCR和WB方法觀察hTERT、PinX1、TRFs的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.CD133+細(xì)胞中PinX1表達(dá)量低于CD133-細(xì)胞

11、，而hTERT的在CD133+細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于CD133-細(xì)胞，表明CD133+細(xì)胞端粒酶活性比CD133-強。
　　2.成功構(gòu)建了PinX1過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA，并通過QPCR和WB驗證了PinX1過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA在CNE2細(xì)胞中的成功影響了PinX1含量。
　　3.在CD133+細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PinX1過表達(dá)質(zhì)粒后hTERT表達(dá)量低于空載質(zhì)粒，而TRF1高于空載組，在CD133-細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PinX1siRNA，