鹽霉毒抑制鼻咽癌干細胞的作用及機理研究.pdf

1、研究背景:
　　 鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，NPC)是發(fā)生于鼻咽粘膜的惡性腫瘤，好發(fā)于中國華南地區(qū)，每100，000人大約有25-50人發(fā)病。鼻咽癌的發(fā)病同EBV病毒感染，遺傳易感性以及接觸某些化學(xué)致癌物有關(guān)。在過去的幾十年里，鼻咽癌的診斷和治療手段逐步提高，但Ⅳ期鼻咽癌5年生存率僅有30％，局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移導(dǎo)致預(yù)后不良。
　　 當(dāng)前越來越多的證據(jù)顯示腫瘤起源于腫瘤干細胞(cancerst

2、emcells，CSCs)，它是一類未分化細胞，具有自我更新、無限增殖和分化的能力，能促使腫瘤組織形成和無限生長，CSCs往往對化療抵抗并導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。因此，殺傷腫瘤干細胞對于成功治療腫瘤至關(guān)重要。
　　 目前分離和鑒定腫瘤干細胞主要有如下幾種方式:1.特異性細胞表面標(biāo)記，細胞表面蛋白如CD24、CD44、CD133和一些胚胎干細胞標(biāo)記物也廣泛應(yīng)用于鑒定腫瘤干細胞;2.側(cè)群細胞，利用DNA染料Hoechst33342染料和

3、流式細胞術(shù)分選，它們依賴ABCG2分子的表達將DNA特異性染料Hoechst33342泵出細胞外，目前已有報道表明SP可應(yīng)用于鑒別和分選鼻咽癌腫瘤干細胞;3.腫瘤球培養(yǎng)，含EGF、bFGF無血清培養(yǎng)基可以促進正常干細胞的體外擴增而不發(fā)生分化，通過無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)形成腫瘤細胞球可以用來富集腫瘤干細胞;4.PKH26標(biāo)記，一種親脂性的紅色熒光染料，可與細胞膜的脂質(zhì)雙分子層不可逆結(jié)合，已有報道PKH26可標(biāo)記靜止期細胞，可作為腫瘤干細胞標(biāo)記，

4、PKH26陽性細胞具有腫瘤干細胞性質(zhì);5.乙醛脫氫酶(ALDH)，已經(jīng)被報道可用作為腫瘤干細胞的標(biāo)記物，乙醛脫氫酶催化乙醛氧化成羧酸，在生物體內(nèi)外的代謝中扮演著重要角色，已有報道稱ALDH可作為多種腫瘤的干細胞標(biāo)記物。
　　 目前已有許多研究表明腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移同腫瘤干細胞密切相關(guān)，傳統(tǒng)的化療藥物只能殺傷非干細胞，腫瘤干細胞假說為超越傳統(tǒng)抗增殖藥物的治療策略的合理性奠定理論基礎(chǔ)。當(dāng)前抑制腫瘤干細胞的策略主要包括:1.阻斷自我更新

5、信號通路;2.逆轉(zhuǎn)其多藥耐藥性;3.誘導(dǎo)腫瘤細胞分化;4.影響調(diào)節(jié)干細胞的microRAN表達。有報道將EMT，腫瘤干細胞和腫瘤耐藥三者比喻為腫瘤發(fā)生過程中的邪惡軸心(axisofevil)，三者可互相轉(zhuǎn)化，microRNA在調(diào)節(jié)三者之間關(guān)系中發(fā)揮著最重要的作用。
　　 長期以來，人們一直期望能找到一種能特異性地抑制CSCs的藥物。但是由于CSCs在腫瘤細胞群中分布之稀少，以及體外培養(yǎng)時的不穩(wěn)定性，使得尋找這樣一種藥物的目標(biāo)遠不

6、可及。當(dāng)前的觀點認為普通化療藥物只能殺傷占腫瘤絕大部分的非腫瘤干細胞，而難以殺傷腫瘤干細胞，只有聯(lián)合使用特異性針對腫瘤干細胞的藥物才有望徹底消除腫瘤。
　　 鹽霉素是一種羧酸聚醚類抗生素，主要用于防止白色鏈霉菌引起的雞球蟲病，當(dāng)前有報道稱鹽霉素具有抑制腫瘤干細胞作用，鹽霉素抑制乳腺癌干細胞的效力比普通抗癌藥物泰克索高100倍。
　　 本研究以常規(guī)化療藥物順鉑作為對照，研究了鹽霉素對鼻咽癌腫瘤干細胞的作用。通過側(cè)群分析，A

7、ldefluor檢測以及腫瘤球形成實驗證明了鹽霉素可以有效抑制鼻咽癌腫瘤干細胞。此外，證實了鹽霉素可通過調(diào)節(jié)miRNA-200c發(fā)揮其抑制腫瘤干細胞的作用。本研究為鹽霉素抑制腫瘤干細胞的作用機制提供了重要的結(jié)論。
　　 研究目的:
　　 1.驗證鼻咽癌腫瘤球干細胞特性;
　　 2.檢測鹽霉素抗鼻咽癌腫瘤干細胞效應(yīng);
　　 3.研究鹽霉素抗腫瘤干細胞分子機制。
　　 方法:
　　 細胞和培養(yǎng)

8、條件:
　　 本實驗所用細胞均由本實驗室保存。人鼻咽癌細胞株培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　 腫瘤球培養(yǎng)和分化實驗:
　　 無血清培養(yǎng)基配制:無血清培養(yǎng)基(serumfreemedium，SFM)由Ham’sDMEM-F12(1:1)、B27(1:50)、EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)組成

9、，將鼻咽癌SUNE-1，5-8F細胞接種于10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，待細胞處于對數(shù)生長期，用PBS液清洗，胰酶消化，消化后再用PBS清洗兩次，置于低粘附培養(yǎng)板中，懸浮于SFM中進行傳代培養(yǎng)，觀察細胞在SFM中形成腫瘤干細胞球的過程，將于SFM中形成的細胞球重新置于SSM中誘導(dǎo)其分化，48h后倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。
　　 免疫熒光:
　　 吸取SFM中形成的腫瘤球至24孔板中（腫瘤球樣品），或吸取S

10、FM中形成的腫瘤球植入預(yù)先放有蓋玻片的6孔板中（腫瘤球分化樣品），4％多聚甲醛固定，PBS清洗，0.2％TritonX-100破膜，PBS清洗，加入一抗37℃孵育45min，PBS清洗，洗滌后加入熒光二抗，37℃孵育45min，PBS清洗，DAPI染細胞核，在共聚焦顯微鏡下觀察。10×KB配方:0.1MTris，pH7.5;1.5MNaCl;1.0％BSA。
　　 MTT檢測:
　　 過濾網(wǎng)將大于40μm的腫瘤球分離出來

11、分離成單個細胞或?qū)?shù)生長期的貼壁細胞分別接種到96孔板中，每孔2000個細胞，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，依濃度梯度加入藥物。藥物作用完畢后每孔加20μlMTT，繼續(xù)培養(yǎng)4～5h，將細胞培養(yǎng)液上清棄去，每孔加入200μlDMSO，搖床混勻約5min。酶標(biāo)儀490nm比色，繪制腫瘤細胞生長曲線。
　　 側(cè)群細胞檢測:
　　 將貼壁細胞或腫瘤細胞分離成單個細胞，離心后用PBS清洗，含2％胎牛血清的1640培基重懸，

12、用Hoechst33342標(biāo)記，標(biāo)記的細胞在37℃孵育90min，PBS洗滌，重懸，檢測前加入PropidiumIodide標(biāo)記死細胞，采用流式細胞儀檢測側(cè)群比例。
　　 Aldefluor檢測:
　　 將貼壁細胞或腫瘤細胞分離成單個細胞，將細胞懸浮于反應(yīng)緩沖液中，調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，測定管中細胞懸液總體積1mL，向測定管中加入激活A(yù)LDH的底物溶液，對照管中加入ALDH特定抑制物DEAB溶液，取出測定管中5

13、00μL細胞懸液加入對照管中，混勻，將測定管和對照管置于37℃孵育40min.離心洗滌后PBS重懸，采用流式細胞儀檢測。
　　 免疫印跡檢測:
　　 蛋白質(zhì)在SDS-PAGE凝膠上進行分析，將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，PVDF膜浸泡在封閉液中25℃2h，一抗4℃孵育過夜，PVDF膜與二抗在室溫下孵育1h，采用化學(xué)發(fā)光法檢測。
　　 細胞轉(zhuǎn)染:
　　 細胞接種在6孔板內(nèi)，待50％細胞匯合后，用Opti-M

14、EM培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，并在室溫孵育10min，在Opti-MEM培養(yǎng)基中稀釋miR-200c抑制物及陰性對照，混合稀釋的miR-200c抑制物/NC和稀釋的Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，室溫孵育10min，將混合物加入培養(yǎng)基中，置于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)。
　　 RNA提取:
　　 細胞總RNA提取:細胞消化，離心，棄上清，加入1mlTrizol;室溫孵育15min

15、，裂解細胞;4℃，12000rpm離心15min，取上清;每1mlTrizol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，冰上孵育15min;4℃，12000rpm離心15min，緩慢取上清，避免吸入中間層的白色物質(zhì)，上層水相體積約為所用Trizol試劑的60％;將吸取的上清置于另一干凈EP管內(nèi)，加入等體積的異丙醇沉淀水樣中的RNA，顛倒混勻，4℃，12000rpm離心15min，見RNA沉淀附著于EP管底和側(cè)壁;棄上清，用預(yù)冷的75％乙醇(1

16、％DEPC水配制)1ml懸浮洗滌沉淀;4℃，7500g離心5min，干燥RNA，用DEPC水溶解沉淀，-80℃保存。
　　 免疫組織化學(xué):
　　 石蠟切片經(jīng)脫蠟，乙醇梯度水化，抗原修復(fù)，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，一抗4℃孵育過夜，二抗25℃孵育10min，DAB顯色，顯微鏡觀察顯色，蘇木素復(fù)染核，鹽酸乙醇分化，脫水，透明。
　　 體內(nèi)成瘤實驗::
　　 接種時細胞用100μl按1:1DMEM和Matrigel

17、懸浮，觀察其成瘤情況如下，記錄小鼠腫瘤發(fā)生的時間;根據(jù)公式V=1/2ab2（a為長徑，b為短徑）計算腫瘤體積，繪制腫瘤成長曲線，腫瘤生長數(shù)周后處死動物取出腫瘤組織。
　　 本課題所用統(tǒng)計學(xué)方法:
　　 采用統(tǒng)計軟件SPSS13.0對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)處理和分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。兩組腫瘤體積比較采用兩獨立樣本T檢驗;腫瘤球形成及直徑，ALDH陽性細胞和側(cè)群比例，凋亡檢測，動物成瘤時間以及原代細胞腫瘤球

18、數(shù)量數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析（One-wayANOVA）比較各組差異，如方差齊性，多重比較采用LSD法;如方差不齊，采用Welch值，多重比較采用DunnettT3法;在體腫瘤生長曲線的比較采用兩因素方差分析(two-wayANOVA)比較各組間差異。P＜0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.培養(yǎng)和鑒定鼻咽癌腫瘤球
　　 (1)免疫熒光和westernblot檢測結(jié)果顯示腫瘤球高表達干細胞標(biāo)記物O

19、ct3/4，Bmi-1，Nanog，Sox2，EpCAM和間充質(zhì)標(biāo)記物vimentin，低表達上皮標(biāo)記物CK5/6;腫瘤球分化后高表達CK5/6;
　　 (2)單個PKH26陽性的細胞可形成腫瘤球，PKH26陽性細胞可代表腫瘤干細胞;免疫熒光結(jié)果顯示腫瘤球有少量細胞同時表達PKH26和干細胞標(biāo)記So×2，CD133和ABCG2;
　　 (3)腫瘤球細胞(18.1％，31.9％)ALDH+細胞比例較分化細胞(1.0％，1.

20、6％)增高;腫瘤球細胞(6.1％)SP細胞比例較分化細胞(2.3％)增高;
　　 (4)腫瘤球細胞較分化細胞增殖速度快;腫瘤球細胞耐藥性(cisplatin)較分化細胞強（IC50＞5倍）;
　　 (5)腫瘤球細胞成瘤能力較分化細胞強，1×104個腫瘤球細胞接種3只裸鼠，2只成瘤，1×104個分化細胞接種裸鼠無腫瘤形成。
　　 2.Salinomycin抑制鼻咽癌腫瘤干細胞的作用
　　 (1)Salino

21、mycin處理組較未處理組和cisplatin處理組腫瘤球形成率低(P=0.000)，腫瘤球體積小(P=0.000);
　　 (2)腫瘤球細胞對salinomycin較cisplatin敏感（IC50＞5倍），分化細胞對salinomycin和cisplatin敏感性無明顯差異;
　　 (3)Cisplatin處理組可增加細胞SP比例，salinomycin處理組可降低細胞SP比例;salinomycin抑制腫瘤球ALD

22、H陽性細胞比例（2μM，P=0.005;5μM，P=0.003），cisplatin無抑制作用(P=0.421);
　　 (4)Salinomycin處理細胞后c-myc，Oct3/4，Nanog蛋白表達降低;
　　 (5)Salinomycin抑制體內(nèi)腫瘤生長較cisplatin作用顯著(P=0.000);salinomycin較cisplatin可顯著推遲腫瘤形成時間(P=0.011);
　　 (6)Sali

23、nomycin治療組原代細胞較cisplatin治療組SP比例低(0.9％vs.2.1％)，ALDH陽性細胞比例較低(0.9％vs.8.6％)，成球率低(P=0.000);
　　 (7)Salinomycin治療組動物成瘤組織壞死明顯;Salinomycin治療組高表達E-cadherin，低表達vimentin和Oct3/4。
　　 3.Salinomycin選擇性抑制腫瘤干細胞分子機制研究
　　 (1)Sal

24、inomycin處理組細胞表達E-cadherin較高，vimentin，SUZ12和Slug較低;
　　 (2)相對于CNE-2細胞，C-666和6-10B細胞表達較高ABCG2，相應(yīng)地，C666和6-10B細胞對salinomycin較CNE-2細胞敏感;Salinomycin可抑制ABCG2和p-glycoprotein的表達;
　　 (3)Salinomycin可抑制β-catenin，cyclinD1和P-AK

25、T表達;
　　 (4)隨著salinomycin濃度增加，細胞凋亡比例逐漸增加(P＜0.05)。
　　 4.Salinomycin通過調(diào)節(jié)miR-200c抑制腫瘤干細胞
　　 (1)Salinomycin處理細胞后提高了miR-200c（＞10倍）;
　　 (2)miR-200c-inhibitor可提高細胞SP比例和腫瘤球形成能力，miR200c-inhibitor可拮抗salinomycin抑制SP的

26、作用(P=0.013)和抑制腫瘤球形成的能力(P=0.001);
　　 (3)miR-200c-inhibitor可降低細胞對cisplatin的敏感性，可增加對salinomycin的敏感性;
　　 (4)細胞經(jīng)miR-200c-inhibitor處理可增加干細胞標(biāo)記物SUZ12和Bmi-1表達，聯(lián)合salinomycin處理可拮抗miR-200c-inhibitor作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.鼻咽