端粒酶催化亞單位啟動子(hTERTp)調(diào)控胸腺嘧啶脫氧核苷激酶基因(TK)靶向性殺傷鼻咽癌移植瘤的實驗研究.pdf

1、南方醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文端粒酶催化亞單位啟動子（hTERTp）調(diào)控胸腺嘧啶脫氧核苷激酶基因（TK）靶向性殺傷鼻咽癌移植瘤的實驗研究姓名：牟少鳳申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：耳鼻咽喉-頭頸外科學(xué)指導(dǎo)教師：文忠20090430中文摘要2 ．1 ．1 ．P C R 引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。端粒酶催化亞單位啟動子：上游引物： 5 ’Q 蚣G A T C T A G T G G A T T CG C G G G C A C A G A 3

2、’ ； 下游引物： 5 ’ G G T G G TA A G C l v I ’A G G G C T T C C CA C G T G C G C A G C A G G A C3 ’，分別含有B g l I I + H i n d l I I 酶切位點， 目的片斷：2 6 2 b p 。T K 基因：上游引物：5 ’ G G T G G T A A G C T r A T G G C T T C G T A C C C C T G

3、C3 ’；下游引物：5 ’G C 弼翻G 省刪G 硎G C C 照C C 么陀3 ’，分別含有H i n d l I I + X b a I 酶切位點，目的片斷：1 ．1 3 9 b p ；C M V 啟動子：上游引物：5 ’一G G G G T A C C T C A A ] 姍G ( 配C A T T A G C C A ．3 ’，下游引物：5 ’．G A A G A TC T G G T G G C T A G C C T A T

4、 A G T G 一3 ’， 分別含有K p n I + B g l l I 酶切位點目的片斷：1 0 6 0 b p ；2 ．1 ．2 h T E R T p 及T K 基因，C M V 的PC R 擴(kuò)增采用分別含有H i n d l I I 與B g l l I 酶切位點的h T E R T p 引物，由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成的h T E R T 啟動子為模板，高保真D N A 聚合酶擴(kuò)增h T E R T p 。采用分別含有

5、X b a I 和H i n dI I I 酶切位點的T K 引物，由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成的T K 為模板，高保真D N A 聚合酶擴(kuò)增T K ，采用分別含有B g lI I 和K p r a 酶切位點的C M V 引物，以含C M V 啟動子?！I熒光素酶P R L ．C M V 質(zhì)粒為模板，高保真D N A 聚合酶擴(kuò)增C M V 。2 ．1 ．3 將P C R 產(chǎn)物進(jìn)行電泳，紫外燈下將目的片段切下，按P C R 產(chǎn)物純化試劑

6、盒進(jìn)行P C R 產(chǎn)物的純化，用H i n d l I I 與B g l l l 分別雙酶t | ] j P C R 產(chǎn)物h T E R T p 和P G L 3 空載體；用X b a I 和H i n d 1 1 1 分別雙酶切P C R 產(chǎn)物T K 和P G L 3 空載體；用H i n d l I I與B g l l l 分別雙酶1 c J J P C R 產(chǎn)物h T E R T p 和T K ／P G L 3 載體，用K p n

7、 I 與B g l l l 分別雙酶切P C R 產(chǎn)物C M V 和P G L 3 空載體，置3 7 。C 水浴中酶切4 d , 時。進(jìn)行電泳，紫外燈下將目的片段切下，采用H i g hp u r eP C R p r o d u c tp u r i f i c a t i o nk i t 分別回收酶切產(chǎn)物后與載體( 按載體與插入片段之摩爾比為1 ：3 ) 建立連接反應(yīng)體系，于4 “ C 連接過夜，構(gòu)建h T E R T p ／P