端粒酶啟動子的克隆及用于腫瘤治療的研究.pdf

1、目的：在腫瘤的基因治療中，使目的基因、特別是細(xì)胞毒性基因在腫瘤細(xì)胞中特異性的表達(dá)十分重要。目前研究證實(shí)，人體大多體細(xì)胞中檢測不到端粒酶活性，而增殖旺盛的細(xì)胞如精原細(xì)胞和造血干細(xì)胞、特別是腫瘤細(xì)胞中端粒酶表達(dá)陽性，使之成為腫瘤基因治療良好的廣譜靶位點(diǎn)。其中利用hTERT啟動子進(jìn)行靶向性基因治療是當(dāng)前熱點(diǎn)之一。本研究的目的是克隆hTERT啟動子，并構(gòu)建在其調(diào)控下LacZ基因真核表達(dá)載體，通過報(bào)告基因表達(dá)，檢測該系統(tǒng)是否能夠有效工作。同時構(gòu)建

2、hTERT啟動子調(diào)控下的tk真核表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)染腫瘤及正常細(xì)胞，觀察hTERT啟動子調(diào)控下的tk/GCV系統(tǒng)是否對腫瘤細(xì)胞系具有特異性殺傷效果。方法：根據(jù)Horikawa報(bào)導(dǎo)的hTERT序列設(shè)計(jì)一對上、下游引物，并在引物的兩端分別引入KpnI和EcoRI位點(diǎn)。提取肝癌細(xì)胞系HepG2基因組DNA，以此為模板，用PCR方法將hTERT序列擴(kuò)增出來，并對序列進(jìn)行測序，以確證序列的正確性。用標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆方法構(gòu)建hTERT啟動子和用以對照的

3、hCMV啟動子調(diào)控下的LacZ和tk基因真核表達(dá)載體。用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將質(zhì)粒pDC511hTERT/LacZ和pDC518hCMV/LacZ轉(zhuǎn)染至人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和正常細(xì)胞系MRC5中，通過β-Ga1染色觀察hTERT啟動子工作情況。同樣地，將pDC511hTERT/tk和pDC518hCMV/tk轉(zhuǎn)染A549和MRC5細(xì)胞后，提取細(xì)胞RNA，用RT-PCR方法擴(kuò)增tk基因，檢測tk基因mRNA轉(zhuǎn)錄情況；同

4、時用MTT法觀察轉(zhuǎn)染后A549和MRC5在不同濃度GCV作用下對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果：成功地克隆了hTERT核心啟動子-208-+40bp序列，經(jīng)測序正確并與Horikawa報(bào)導(dǎo)的完全一致。成功地構(gòu)建一系列分別由hTERT啟動子和hCMV啟動子調(diào)控下的LacZ和tk基因表達(dá)載體，包括pDC511hTERT、pDC511hTERT/LacZ、pDC511hTERT/tk和pDC518hCMV/tk。pDC511hTERT/LacZ和p

5、DC518hCMV/LacZ轉(zhuǎn)染A549和MRC5細(xì)胞36小時后，β-Ga1染色可見pDC518hCMV/LacZ轉(zhuǎn)染組A549和MRC5均有細(xì)胞染色，而pDC511hTERT/LacZ轉(zhuǎn)染組僅腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)549有細(xì)胞著色，表明hTERT啟動子可使報(bào)告基因特異性表達(dá)于端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞。相似地，將pDC511hTERT/tk和pDC518hCMV/tk轉(zhuǎn)染A549和MRC5細(xì)胞48小時后，用RT-PCR方法檢測細(xì)胞中tk基因mRNA轉(zhuǎn)

6、錄情況，結(jié)果顯示：pDC518hCMV/tk轉(zhuǎn)染的兩者細(xì)胞均可擴(kuò)增得到tk基因，而pDC5¨hTERT/tk轉(zhuǎn)染組僅在A549細(xì)胞系中擴(kuò)增得到tk基因，表明hTERT啟動子可有效地調(diào)控其下游tk基因mRNA在端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞中的特異性轉(zhuǎn)錄。分別轉(zhuǎn)染了pDC511hTERT、pDC511hTERT/tk和pDC518hCMV/tk的A549和MRC5細(xì)胞48小時后加入不同劑量的GCV(1、10和100μg/ml)作用3天后通過MTT法檢

7、測GCV對各組細(xì)胞的抑制和殺傷情況，結(jié)果顯示：hCMV啟動子調(diào)控的tk產(chǎn)物能有效地但無選擇性地轉(zhuǎn)化GCV，導(dǎo)致對MRC5和A549細(xì)胞有較高的細(xì)胞殺傷率，細(xì)胞殺傷率與GCV濃度呈線性關(guān)系；而hTERT啟動子調(diào)控的tk組僅在A549細(xì)胞系中觀察到明顯的細(xì)胞毒性作用，細(xì)胞殺傷率與GCV濃度相關(guān)，呈現(xiàn)劑量關(guān)系，1、10和100μg/ml的GCV對A549的抑制率分別是21.5％、32.8％和46.1％。結(jié)論：hTERT啟動子可特異性地調(diào)控目的