端粒端粒酶的研究進(jìn)展

1、端粒、 端粒酶的研究進(jìn)展,早在30年代，兩名遺傳學(xué)家Muller和Mcclintock分別在不同的實(shí)驗(yàn)室用不同的生物做實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)染色體末端結(jié)構(gòu)對(duì)保持染色體的穩(wěn)定十分重要，Muller將這一結(jié)構(gòu)命名為端粒（telomere）。直到1985年Greider等從四膜蟲(chóng)中真正證實(shí)了端粒的結(jié)構(gòu)為極簡(jiǎn)單的6個(gè)核苷酸TTAGGG序列的多次重復(fù)后發(fā)現(xiàn)了端粒酶(telomerase TRAP-eze) 。,在端粒被發(fā)現(xiàn)以前，人們就推測(cè)生殖細(xì)胞之所以能世代相

2、傳，其中可能存在一種維持端粒長(zhǎng)度的特殊機(jī)制，體細(xì)胞可能正是由于缺乏這種機(jī)制，它的染色體末端才面臨著致死性缺失（deletion）的危險(xiǎn)。因此在正常人體細(xì)胞間永生化細(xì)胞（immortalized cells）及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程中可能也存在著與生殖細(xì)胞類(lèi)似的機(jī)制，但這一直末予證實(shí)。十多年來(lái)對(duì)端粒和端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能有了較深入的認(rèn)識(shí)。,一、人類(lèi)染色體端粒及端粒酶： 1972年James Watson提出了“復(fù)制末端問(wèn)題” ，復(fù)

3、制DNA的DNA多聚酶并不能將線(xiàn)性染色體末端的DNA完全復(fù)制。也就是說(shuō)在線(xiàn)性DNA復(fù)制時(shí)，DNA多聚酶留下染色體末端一段DNA（一段端粒）不復(fù)制。端粒DNA復(fù)制的特點(diǎn)是在每次DNA 復(fù)制中，每條染色體的3‘端均有一段DNA無(wú)法得到復(fù)制，隨著細(xì)胞每次分裂， 染色體3’一末端將持續(xù)喪失50-200bp的DNA，因而細(xì)胞分裂具有一定的限度，即分裂壽命。 所以端粒的長(zhǎng)度可作為細(xì)胞的“分裂時(shí)鐘”，反映細(xì)胞分裂能力。真核細(xì)胞染色體末端會(huì)隨著細(xì)胞分裂

4、而縮短，這個(gè)縮短的端粒再傳給子細(xì)胞后，隨細(xì)胞的再次分裂進(jìn)一步縮短 。,隨著每次細(xì)胞分裂，染色體末端逐漸縮短，細(xì)胞進(jìn)入不可逆的抑制狀態(tài)，直至細(xì)胞衰老，此過(guò)程即稱(chēng)為復(fù)制性衰老。人類(lèi)體細(xì)胞遵循這個(gè)規(guī)則從細(xì)胞出生到衰老，單細(xì)胞生物遵循這個(gè)規(guī)則分裂后定有其它機(jī)制保持單細(xì)胞生物傳代存活，生殖細(xì)胞亦如此，這些細(xì)胞怎樣保持細(xì)胞具有繼續(xù)分裂或長(zhǎng)期分裂的能力呢？科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)端粒確實(shí)隨著每次分裂而縮短，但也會(huì)被新合成的端粒片斷再延長(zhǎng)?？茖W(xué)家們懷疑，可能尚有末

5、被發(fā)現(xiàn)的酶，該酶具有標(biāo)準(zhǔn)的DNA多聚酶所不具備的功能，能使已縮短的端粒延長(zhǎng)，使科學(xué)家們興奮的是到1985年首先在四膜蟲(chóng)中證實(shí)了這種能使端粒延長(zhǎng)的酶—端粒酶的存在。,端粒（telomere）是真核細(xì)胞線(xiàn)性染色體未端的一種特殊結(jié)構(gòu)，由簡(jiǎn)單重復(fù)富含G堿基的DNA序列及端粒結(jié)合蛋白共同構(gòu)成。人類(lèi)染色體端粒序列已分離克隆，主要由5-15個(gè)kb的5`TTAGGG3`上千次的重復(fù)序列構(gòu)成，它就像二頂帽子蓋在染色體兩端，能保持遺傳信息的完整性，保護(hù)染色

6、體免受重組和未端降解酶的作用，并提供一種可消耗的非編碼序列以暫時(shí)緩解或取消復(fù)制問(wèn)題所帶來(lái)的染色體DNA的進(jìn)行性縮短。大多數(shù)體細(xì)胞的端粒隨周期性復(fù)制而逐漸縮短，最終達(dá)到一個(gè)臨界點(diǎn)，細(xì)胞增殖停止、死亡，這可能是生命有限的重要原因之一。,體細(xì)胞的端粒有限長(zhǎng)度（telomere restriction fragments TRFS）大多數(shù)明顯短于生殖細(xì)胞，青年人的TRFs又顯著長(zhǎng)于年長(zhǎng)者，提示TRFs隨著細(xì)胞分裂或衰老，在不斷變短，主要是由于D

7、NA聚合酶不能完成復(fù)制成線(xiàn)性DNA末端所致。缺少端粒的染色體不能穩(wěn)定存在，這是因?yàn)槎肆NA與結(jié)構(gòu)蛋白形成的復(fù)合物如同染色體的一頂“帽子”，它既可保護(hù)染色體不被降解，又避免了端粒對(duì)端融合（end-end fusion）以及染色體的喪失，同時(shí)端粒能幫助細(xì)胞識(shí)別完整染色體和受損染色體。在生理情況下，端粒作為細(xì)胞“分裂時(shí)鐘”能縮短，最終導(dǎo)致細(xì)胞脫離細(xì)胞周期。,端粒酶（telomerase）催化端粒合成，是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，能以自身的RNA為模板，

8、反向合成—TTAGGG—，不斷地加在DNA未端，腫瘤細(xì)胞能夠不斷地分裂增生，“端粒酶—RNA”結(jié)構(gòu)的存在是先決條件。 現(xiàn)認(rèn)為，人的端粒酶RNA可分為兩個(gè)區(qū)與引物作用：一個(gè)是模板區(qū)，含有與引物互補(bǔ)的11個(gè)核苷酸模板區(qū)序列為11nt(5`CUAACCCUAAC-3’）；另一個(gè)錨定區(qū)，與引物的5’端相配，為DNA鏈向3’ 端正核酶外延伸提供路徑，而端粒酶中的蛋白質(zhì)則起催化反應(yīng)合成的作用。,人類(lèi)端粒酶RNA（human telo

9、menese RNA hTR）是細(xì)胞端粒合成不可缺少的模板，若模板區(qū)突變，缺失或反義RNA可導(dǎo)致端粒的相應(yīng)改變或丟失。經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞端粒序列發(fā)生改變，細(xì)胞即出現(xiàn)凋亡或分化。hTR非模板區(qū)序列或空間構(gòu)象的變化也可使端粒酶失去活性。在胃癌及神經(jīng)腫瘤的研究中已發(fā)現(xiàn)，hTR表達(dá)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。端粒酶是在染色體末端不斷合成端粒序列的酶，它可以維持端粒的長(zhǎng)度，維持細(xì)胞增殖潛能。,端粒酶由RNA和蛋白質(zhì)兩部分組成。以自身RNA為模板合成端粒酶重復(fù)序

10、列，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，它的活性不依賴(lài)于DNA聚合酶，對(duì)RNA酶、蛋白酶和高溫均敏感。端粒酶活性表達(dá)能穩(wěn)定端粒的長(zhǎng)度，抑制細(xì)胞的衰老，在生殖細(xì)胞和干細(xì)胞中可檢測(cè)到高水平的端粒酶活性。,二、死亡期細(xì)胞假說(shuō)與細(xì)胞永生化 細(xì)胞獲得永生必須克服兩個(gè)危機(jī)期，M1（mortality stage 1）和M2（mortality stage 2）在M1期細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子等失去反應(yīng)，產(chǎn)生DNA合成蛋白抑制因子，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)（cell cyc

11、le checkpoints）發(fā)送細(xì)胞周期停止信號(hào)，DNA合成即告停止。細(xì)胞端粒開(kāi)始縮短，并啟動(dòng)終止細(xì)胞分裂信號(hào)，正常人的雙倍體細(xì)胞不能進(jìn)一步分裂，開(kāi)始衰老、死亡。一些癌基因SV40T抗原、抑癌基因P53，和Rb突變均能使M1期的機(jī)制被抑制,使細(xì)胞逃逸M1期，繼續(xù)生長(zhǎng)獲得額外的增殖能力，此時(shí)端粒酶仍為陰性，端粒繼續(xù)縮短，經(jīng)過(guò)20-30次分裂后，最終到達(dá)M2期。此時(shí)因端粒太短而致染色體極不穩(wěn)定，于是大多數(shù)細(xì)胞退化死亡，極少數(shù)細(xì)胞由于激活了

12、端粒酶，端粒功能得以恢復(fù)，染色體形態(tài)穩(wěn)定，可以超越M2期使細(xì)胞永生化。,端粒酶被抑制 正常人體細(xì)胞 端粒丟失 M1期阻滯

13、 SV40T抗原 細(xì)胞分裂停止 Rb、P53與病毒蛋白結(jié)合、突變 ↓ M1—M2期間隔 永生化 雙著絲粒形成 ↓

14、 M2期退化 染色體失穩(wěn) 端粒酶被激活 細(xì)胞凋亡,附圖：端粒酶在人體細(xì)胞永生性轉(zhuǎn)化中,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,三、端粒酶與腫瘤發(fā)生 端粒酶是最近腫瘤研究的熱門(mén)話(huà)題。端粒酶具有使腫瘤細(xì)胞系繼續(xù)復(fù)

15、制生存的特點(diǎn)，成為近期生命科學(xué)界關(guān)心與研究的一個(gè)熱點(diǎn)。端粒缺陷的染色體不穩(wěn)定性通過(guò)促進(jìn)半合子化（hemizygosing）、轉(zhuǎn)位（tranlocation）、擴(kuò)增及重組裝而加速腫瘤進(jìn)程。端粒磨耗（attrition）的最終結(jié)果是端粒酶的活化，以彌補(bǔ)端粒的丟失而使細(xì)胞無(wú)限增殖，成為永生細(xì)胞。因此端粒酶活化是腫瘤進(jìn)入晚期，而且是細(xì)胞永生的關(guān)鍵一步。,為什么在絕大多數(shù)永生細(xì)胞系可以表達(dá)端粒酶活性，而在非永生細(xì)胞則不能？

16、 為什么人類(lèi)大多數(shù)體細(xì)胞中不能檢測(cè)到端粒酶，而在一些腫瘤細(xì)胞中則能檢測(cè)到端粒酶？,近年來(lái)圍繞這一問(wèn)題展開(kāi)了大量的研究，積累了豐富的資料，至今仍是一個(gè)值得探討的領(lǐng)域。自從1994年Kim等創(chuàng)立TRAP法檢測(cè)端粒酶活性以來(lái)，越來(lái)越多的文獻(xiàn)證明端粒酶活性在大多數(shù)人類(lèi)原發(fā)性腫瘤標(biāo)本及腫瘤衍生細(xì)胞系中可被檢測(cè)到，如前列腺癌、乳癌、口腔癌、肺癌、肝癌、胃腸基質(zhì)瘤、膀胱上皮細(xì)胞癌及AML急性髓性白血病。,Shay等報(bào)道了幾年不同學(xué)者對(duì)腫瘤端

17、粒酶探討的檢測(cè)結(jié)果，總結(jié)了正常組織（196例），原位癌（410例），惡性腫瘤（2031例）和癌旁組織（690例）的端粒酶的陽(yáng)性率，它們分別是0.5%、30%、85%和11%。在前列腺癌、乳腺、胰腺、肺、肝的早期癌中端粒酶的陽(yáng)性率為85.0%~95.0%，而對(duì)應(yīng)的癌旁或良性病變組織中，端粒酶基本上不能檢出或活性極微弱。因此，盡管有研究認(rèn)為，端粒長(zhǎng)度維持還可以借助于非端粒酶依賴(lài)模式，即ALT（altematire Lengthening o

18、f telomere）機(jī)制，但其存在上并不能否認(rèn)永生化細(xì)胞中端粒酶的重要作用。,美國(guó)學(xué)者在400多例來(lái)源于12 種不同組織的原發(fā)腫瘤病例中，腫瘤組織的端粒酶陽(yáng)性率高達(dá)84.8％，而腫瘤周?chē)M織或良性病變中陽(yáng)性率僅為4.4％，說(shuō)明端粒酶活性與腫瘤生物學(xué)行為密切相關(guān)。 端粒酶陽(yáng)性的腫瘤比陰性的腫瘤有更大的惡性?xún)A向。通過(guò)PCR技術(shù)形成的端粒重復(fù)擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)前列腺癌，31例中有27例（87%）有高表達(dá)的酶活性，國(guó)內(nèi)劉洪坤總結(jié)有84%前列腺癌中檢

19、測(cè)到端粒酶活性。端粒酶可能是保持前列腺癌細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)必須的酶，在細(xì)胞惡變過(guò)程中端粒酶激活是個(gè)非常重要的步驟。,有學(xué)者用鼠皮膚做模型，進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)致癌，分析處于乳腺癌不同階段的端粒酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)早期乳腺癌細(xì)胞是二倍體細(xì)胞，分化較好，而晚期乳腺癌則是非整倍體細(xì)胞且分化較差，同時(shí)端粒酶活性進(jìn)行性增加，并伴隨著基因水平的不穩(wěn)定性。在隨后的研究中也得出了相同的結(jié)論，表明人乳腺癌的進(jìn)程與端粒酶的活化密切相關(guān)，提示端粒酶可以作為診斷乳腺癌的指標(biāo)。,

20、美國(guó)學(xué)者在慢性髓性白血病（CML）和急性髓性白血?。ˋML）的端粒動(dòng)力學(xué)研究中，用southern印跡法測(cè)量端粒長(zhǎng)度，用stretch-PCR法測(cè)出端粒酶活性，在CML白細(xì)胞中，端粒酶活性非常低與正常組織相似。但若CML急性發(fā)作時(shí)，白細(xì)胞中端粒酶活性就表現(xiàn)為顯著升高。表明CML由慢性到急性發(fā)作時(shí)，高度激活了端粒酶。通過(guò)對(duì)CML和AML病情進(jìn)展研究，發(fā)現(xiàn)所有病例中腫瘤細(xì)胞的端粒與相應(yīng)正常細(xì)胞相比都是縮短的，這可能是由于腫瘤細(xì)胞分裂次數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)

21、大于正常細(xì)胞之故。,端?？s短和端粒酶激活的情況，人們稱(chēng)之為端粒危機(jī)，這是腫瘤細(xì)胞克隆繁衍的強(qiáng)大驅(qū)動(dòng)力，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。有些實(shí)體腫瘤細(xì)胞中端粒并末縮短而是延長(zhǎng)出現(xiàn)了矛盾的現(xiàn)象。 端粒危機(jī)的的假說(shuō)有兩種解釋?zhuān)?、由于大量正常細(xì)胞混跡于實(shí)體腫瘤樣品中，因而用印跡轉(zhuǎn)移分析法來(lái)檢驗(yàn)端粒長(zhǎng)度是不可信的。2、白血病與實(shí)體腫瘤細(xì)胞克隆繁衍機(jī)制不同。,許多血液學(xué)的惡性腫瘤都不會(huì)在局部形成腫瘤，細(xì)胞的增殖和循環(huán)都是單細(xì)胞的，因此每一個(gè)白血

22、病細(xì)胞都將競(jìng)爭(zhēng)更有效的增殖，端粒酶在單個(gè)白血病細(xì)胞中的表達(dá)是強(qiáng)烈的，瘤細(xì)胞分裂快速，端粒縮短，使突變細(xì)胞在短期內(nèi)形成群落。與此相反實(shí)體腫瘤位于一點(diǎn)而不移動(dòng)，因此子代對(duì)于不同突變的競(jìng)爭(zhēng)被其緊鄰所限制。實(shí)體腫瘤中大多數(shù)成功的克隆將比白血病細(xì)胞有更穩(wěn)定的遺傳特性。因?yàn)槲挥谔厥猸h(huán)境中的特殊表型必須保持相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間才能克隆形成群落，所以實(shí)體腫瘤只有具備較長(zhǎng)的端粒，才能有較穩(wěn)定的遺傳特性，具備“最好”的表型從而被選擇，進(jìn)而生長(zhǎng)繁殖。,附表 人體

23、組織中端粒酶活性,,端粒長(zhǎng)度是維持細(xì)胞永生所必須，從正?！愿窝住斡不伟?，端粒的長(zhǎng)度進(jìn)行性縮短，Tahara 檢測(cè)33例原發(fā)性肝癌，其中28例（84.4%）有端粒酶活性，而在肝炎和肝硬化中均有低活性的酶存在，提示端粒酶活化可能在原發(fā)性肝細(xì)胞癌癌變過(guò)程中起重要作用。,更令人感興趣的是乳腺細(xì)針穿刺標(biāo)本，尿標(biāo)本，膀胱和腸腔沖洗液脫落細(xì)胞的端粒酶活性檢測(cè)中惡性腫瘤也有較高的陽(yáng)性表達(dá)，這可能有助于腫瘤的早期診斷。Hiyama等 對(duì)胃癌患者

24、進(jìn)行端粒酶研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶陽(yáng)性患者其病灶較陰性者大，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率也高，預(yù)后差 。,然而，端粒酶與惡性腫瘤之間是否平行還有著很大的分歧。Hiyama等研究發(fā)現(xiàn)端粒酶活性的高低與神經(jīng)母細(xì)胞瘤預(yù)后相關(guān)，高者預(yù)后差，低者預(yù)后好，在肺癌中，端粒酶活性高低與惡性度有相關(guān)性，胃癌、乳癌亦有類(lèi)似的結(jié)果報(bào)告，但胃癌的端粒酶活性與腫瘤病理分級(jí)、DNA倍體、分期和預(yù)后間未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)性。胡震研究認(rèn)為端粒酶活性與腎細(xì)胞癌的病理分級(jí)、臨床分期有正相關(guān)系，而賈瑞鵬等

25、報(bào)道認(rèn)為端粒酶活性與臨床分期、病理分級(jí)無(wú)明顯相關(guān)性，由此看來(lái)，各種惡性腫瘤的端粒酶表達(dá)陽(yáng)性率不同，與腫瘤的惡性度相關(guān)性也不同。,,有研究者在轉(zhuǎn)基因小鼠的模型中發(fā)現(xiàn)，端粒酶活性?xún)H在較晚期腫瘤中表達(dá)，而鼠端粒酶RNA（MTR）水平在癌前期即上調(diào)，且hTR水平與端粒酶活性并不平行[36]，Aviciion等對(duì)人腫瘤細(xì)胞株和惡性腫瘤標(biāo)本的研究中也觀(guān)察到類(lèi)似結(jié)果，即hTR含量高的部分細(xì)胞株不表達(dá)端粒酶活性，而后隨端粒酶增高，hTR水并不相應(yīng)增加，

26、這些結(jié)果提示端粒酶是在腫瘤進(jìn)展的晚期被激活，而端粒酶RNA活性的上調(diào)是一早期事件。,基于這現(xiàn)象，在腫瘤治療方面，是否可以設(shè)計(jì)一些藥物來(lái)抑制端粒酶hTR表達(dá)的上調(diào)，減少端粒酶的活化有可能達(dá)到防治腫瘤和預(yù)防復(fù)發(fā)的目的，也有人利用反義核酸封閉hTR模板區(qū)，錘頭狀切割hTR特異序列或使hTR模板區(qū)定點(diǎn)突變、或改變hTR的空間構(gòu)象等，消除hTR作為模板的功能，限制其合成端粒酶的作用。,四.端粒酶與腫瘤細(xì)胞凋亡 眾所周知，細(xì)胞凋亡對(duì)

27、腫瘤有負(fù)調(diào)控作用，在惡性腫瘤的發(fā)生及演變過(guò)程中，一系列調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡的機(jī)制都發(fā)生了紊亂，包括：細(xì)胞周期的調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)途徑、細(xì)胞凋亡、癌基因與抑制因的表達(dá)等，啟動(dòng)凋亡的某些基因位于端粒酶結(jié)構(gòu)附近，完整的端粒結(jié)構(gòu)可以抑制這些基因的表達(dá)伴隨著細(xì)胞的分裂，正常體細(xì)胞染色體未端的端粒進(jìn)行性變短，最后凋亡基因被啟動(dòng)，細(xì)胞進(jìn)入死亡階段。,Fu等發(fā)現(xiàn)，端粒酶具有抑制細(xì)胞凋亡的功能，且在端粒酶活性抑制的情況下，Bcl-2和Caspases抑制因子具

28、有保護(hù)細(xì)胞免受凋亡的作用。因此，具有端粒酶活性和穩(wěn)定的端粒長(zhǎng)度的細(xì)胞，可以阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。故表達(dá)端粒酶活性的惡性腫瘤細(xì)胞具有抗凋亡的能力，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，端粒酶的激活就是細(xì)胞凋亡機(jī)制受抑的原因之一。,五. 端粒酶與細(xì)胞周期 盡管目前有關(guān)端粒酶與細(xì)胞周期細(xì)的關(guān)系尚不清楚，但體外培養(yǎng)細(xì)胞同步化研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期的不同階段，端粒酶的活性也不同，端粒酶活性在G1/S期進(jìn)行性增加并于S期達(dá)到最大，在G2/M期活性幾乎測(cè)不到，提示

29、端粒酶維持端粒穩(wěn)定的作用，可能S期處于活化狀態(tài)，在非復(fù)制期處于靜止?fàn)顟B(tài)。對(duì)細(xì)胞周期有抑制作用的藥物也能影響到端粒酶的活性。,Aldous等用抗雌激素藥物tamoxifen處理MCF-7gc癌細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)伴隨著MCF-7細(xì)胞周期受抑于G0/G1期，端粒酶活性也隨之下凋，但temoxifen并無(wú)直接抑制端粒酶活性的作用，Akjycma等發(fā)現(xiàn)用IFN-2處理Daudi淋巴瘤細(xì)胞，可使細(xì)胞周期停滯于G1期，端粒酶活性也明顯下降，Sharma等用

30、DMSO誘導(dǎo)人BurKitt淋巴瘤細(xì)胞Raji，可使之進(jìn)入可逆的G0/G1期停滯狀態(tài)，且不伴有可檢測(cè)的分化表型改變；在此過(guò)程中，端粒酶活性呈動(dòng)態(tài)改變，說(shuō)明端粒酶活性的調(diào)節(jié)是細(xì)胞周期依賴(lài)性的。,有研究表明，轉(zhuǎn)染反義端粒RNA在封閉細(xì)胞的酶端?；钚员磉_(dá)的同時(shí)，伴發(fā)P21與P16表達(dá)水平的升高。P16和P21均在細(xì)胞周期的調(diào)控中起重要作用，均屬于細(xì)胞周期蛋白激酶抑制蛋白，對(duì)G1/S期轉(zhuǎn)換起負(fù)調(diào)節(jié)作用，它們通過(guò)影響CDK的活性阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，

31、P21在轉(zhuǎn)錄水平還受P53的調(diào)控，即參與細(xì)胞調(diào)亡的調(diào)控。以上提示，由于在S期細(xì)胞端粒酶的活性受到抑制，并繼發(fā)引起細(xì)胞周期蛋白激酶抑制因子P16和P21表達(dá)水平的顯著增高，從而使細(xì)胞在G1/S期轉(zhuǎn)換受阻而影響細(xì)胞從G1期過(guò)渡到S期，并有可能延長(zhǎng)細(xì)胞周期。,六、端粒酶與腫瘤抑制基因 抑癌基因Rb，P53 ，P16可以抑制細(xì)胞周期蛋白激酶，阻滯細(xì)胞分裂 ，但這些基因單獨(dú)失活并不能誘發(fā)細(xì)胞永生。一些DNA腫瘤病毒可以使P53 ，

32、Rb基因失活，增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力。在一種與突變P53基因遺傳有關(guān)的家族性癌癥綜合征Li-Fraumeni綜合征病人中，對(duì)其成纖維細(xì)胞自發(fā)性永生過(guò)程進(jìn)行觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)單純P53突變或缺失可使細(xì)胞暫時(shí)脫離衰老，但不能避免退化。,在永生化細(xì)胞IV-CF中既有P53失活，又有P16表達(dá)缺失，還有端粒延長(zhǎng)，但缺乏端粒酶活性，提示在體內(nèi)細(xì)胞永生中還存在一種延長(zhǎng)端粒的機(jī)制。 有些病毒蛋白具有多效性（pleiotropic effects），它

33、不僅能與Rb，P53等抑癌基因結(jié)合，而且還可能與其它未辯明的因子結(jié)合。 說(shuō)明端粒酶僅是引起細(xì)胞永生的一種機(jī)制，除此以外，還有使細(xì)胞永生的其它機(jī)制，還有保持端粒長(zhǎng)度的其它機(jī)制，有待于進(jìn)一步的研究。,七、端粒酶與衰老,衰老即為老化，有生理性和病理性，生理性衰老(aging)是生物體自成熟期開(kāi)始，隨年齡增長(zhǎng)發(fā)生的，并受遺傳因素的影響，表現(xiàn)為全身復(fù)雜的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能不可逆的退行性變化，而疾病或異常因素可引起病理性衰老（senility），是

34、衰老現(xiàn)象的提早出現(xiàn)。 Faragher指出衰老細(xì)胞逐漸積累會(huì)導(dǎo)致人體衰老的進(jìn)程（但不排除其它因素），正如美國(guó)科學(xué)家戴維、施萊辛格在2002年國(guó)際人類(lèi)基因組大會(huì)所說(shuō)的，人的干細(xì)胞有著旺盛的活力，但是細(xì)胞有新陳代謝，隨著年齡的增長(zhǎng)，很多功能細(xì)胞因?yàn)槔匣蚰p而喪失了原有的功能，然而他們卻無(wú)法被排出體外，這些“失靈”的細(xì)胞越積越多，以致最終防礙了其它細(xì)胞的“正常工作”，這很可能是人類(lèi)衰老的真正因素。,對(duì)于人體衰老的延遲，一直都是人類(lèi)

35、不斷追求的，端粒與端粒酶的發(fā)現(xiàn)為人類(lèi)抗衰老帶來(lái)了曙光。在體外培養(yǎng)中，衰老細(xì)胞部分隨著增殖會(huì)逐漸增多。既然端粒酶活性表達(dá)能穩(wěn)定端粒的長(zhǎng)度，那么端粒在細(xì)胞復(fù)制中就不會(huì)喪失，細(xì)胞衰老的進(jìn)程就可能被阻止，從而延長(zhǎng)壽命—這是人們研究端粒酶與抗衰老關(guān)系的熱點(diǎn)。 中國(guó)科學(xué)家董坦君等研究發(fā)現(xiàn)P16基因并非通過(guò)激活端粒酶，而是通過(guò)調(diào)節(jié)Rb蛋白的活性來(lái)影響端粒的長(zhǎng)度，抑制P16基因的表達(dá)，端粒長(zhǎng)度縮短減緩，細(xì)胞壽命延長(zhǎng)，衰老程度減輕。

36、 Fuxe等報(bào)道P15的過(guò)度表達(dá)引起的復(fù)制性衰老方向與P16有相似的能力，同樣伴有完整的Rb蛋白途徑。,端粒酶延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度以減緩細(xì)胞衰老最早的證據(jù)來(lái)自Bodrar等的研究，1998年在Science上刊文報(bào)道：將人的端粒酶基因?qū)攵肆ｊ幮缘恼Ｈ梭w細(xì)胞中，激活其表達(dá)并培養(yǎng)細(xì)胞，然后與未導(dǎo)入該基因的細(xì)胞比較，發(fā)現(xiàn)前者端粒顯著延長(zhǎng)，細(xì)胞分裂旺盛，細(xì)胞壽命比后者大大延長(zhǎng)，更值得關(guān)注的是細(xì)胞并無(wú)腫瘤樣改變。另外，Targ等發(fā)現(xiàn)一些正常嚙齒

37、動(dòng)物的先驅(qū)細(xì)胞有一個(gè)無(wú)限制的增殖能力，但其培養(yǎng)需在避免分化和阻止細(xì)胞循環(huán)反應(yīng)活性的前提下，Kudo等報(bào)道端粒酶活性和細(xì)胞凋亡可作為宮內(nèi)發(fā)育延遲的胎盤(pán)衰老的指標(biāo)。,Maffson等認(rèn)為在神經(jīng)細(xì)胞分化和存活中，端粒酶與TERT功能的測(cè)定能較好理解神經(jīng)細(xì)胞的功能，并可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞在各種各樣神經(jīng)元退化性病變條件下的恢復(fù)。阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease,AD）是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退化性老年病，其患者腦血管壁中可分離出致AD

38、神經(jīng)元退行性病變的β－淀粉樣蛋白，zhu等利用antisense技術(shù)和端粒酶抑制劑引發(fā)胎鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞中TERT的功能抑制，發(fā)現(xiàn)顯著增加了由β－淀粉樣蛋白肽引起的細(xì)胞凋亡，而在腦細(xì)胞瘤中TERT的過(guò)量表達(dá)會(huì)降低這種細(xì)胞凋亡，其原因是TERT降低的神經(jīng)細(xì)胞由于暴露于β－淀粉樣蛋白中而增強(qiáng)了其氧化性，并使線(xiàn)粒體功能發(fā)生障礙，TERT在神經(jīng)退行性病變中展現(xiàn)出神經(jīng)的保護(hù)功能，提示在神經(jīng)細(xì)胞中提高端粒酶活性可以抵止年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性病變，如A

39、D和腦老化等。,激活端粒酶可以阻止衰老的過(guò)程，延長(zhǎng)壽命，可是一旦激活端粒酶，這些細(xì)胞將有可能成為永生化細(xì)胞，衍化成癌細(xì)胞，為避免衰老而導(dǎo)致癌癥，這顯然不是人們的初衷。但Shay等認(rèn)為導(dǎo)入端粒酶的細(xì)胞不會(huì)成為癌細(xì)胞，這是因?yàn)榧?xì)胞本身并未累積成為癌細(xì)胞所需的改變。不過(guò)研究的重點(diǎn)還是應(yīng)放在端粒酶的調(diào)控機(jī)制和細(xì)胞繁殖能力上，避免細(xì)胞無(wú)限分裂增殖而引發(fā)的腫瘤。,八、端粒酶的檢測(cè)方法 1、TRAP： Kim等在1994年

40、建立了能穩(wěn)定，成批，快速分析各組織端粒酶活性的Trap方法。在小塊組織甚至穿刺組織上提取少量組織進(jìn)行端粒酶活性測(cè)定，Kim等利用PCR為基礎(chǔ)的TRAP（telomeric repeat amplification protocol）方法，包括通過(guò)改良的去污溶解手段從少量細(xì)胞中獲取富含端粒酶的提取物，然后利用端粒酶催化的引物延伸反應(yīng)產(chǎn)物作為聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的模板，允許產(chǎn)物呈指數(shù)擴(kuò)增，建立了一種高效、特異的、敏感的端端重復(fù)擴(kuò)增法（TR

41、AP），其敏感性較傳統(tǒng)擴(kuò)增法提高了一萬(wàn)倍。,Kim指出端粒酶在腫瘤診斷中敏感性達(dá)85%，特異性達(dá)91%，標(biāo)本中少至10個(gè)癌細(xì)胞即可測(cè)得端粒酶陽(yáng)性。腹水、內(nèi)鏡下、細(xì)胞刷、細(xì)針穿刺、ERCP均可測(cè)定之，較病理檢測(cè)陽(yáng)性率高。此外還可應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)-酶聯(lián)免疫吸附法（PCR-ELISA）方法及分子生物學(xué)原位雜交技術(shù)檢測(cè)端粒酶。 最近，Soriac等對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的病人通過(guò)外周血單核細(xì)胞俘獲的上皮細(xì)胞檢測(cè)出端粒酶陽(yáng)性，特異性和敏感

42、性均高，且為非侵入性的方法，這為端粒酶的檢測(cè)提出了一新的途徑。,TRAP檢測(cè)方法： ①制備S-100提取液，取出-80℃凍存的待檢細(xì)胞，加20ul細(xì)胞裂解液[0.5%CHAPS,10mmol/L Tris-HCL (PH 7.5),1mmol/l MgCl2,1mmol/l EGTA,5mmol/l β-巰基乙醇，0.1mmol/l苯甲基磺酰氟，10%甘油酊]，加樣器反復(fù)吹打3次混勻，冰溶30min ，12000g 4℃

43、離心 20min，收取上清，用Folicn-酚法進(jìn)行蛋白定量。-80℃保存或檢測(cè)。,② 端粒酶介導(dǎo)的端粒重復(fù)序列延伸： 取1ul S-100提取液（或取6ug蛋白質(zhì)）在50ulTRAP反應(yīng)液[20mmol/l Tris-Hcl(PH8.3), 1.5mmol/l MgCl2, 68mmol/l KCl, 0.05%Tween-20, 0.1mmol/l EGTA, 50mmol/l dNTP],含0.1ug Ts引物

44、；0.5umol/l T4g32蛋白，2u Taq DNA多聚酶，室溫30min，上述反應(yīng)均需無(wú)RNA酶操作。,③ PCR擴(kuò)增端粒重復(fù)序列： 室溫延伸后加引物0.1ug,94℃ 2min 變性 94℃ 30S ， 50℃ 30S ，72℃ 30S 40個(gè)循環(huán)。 ④ 10%聚丙烯凝膠電泳，17SV 45min ,280V 105min后銀染色。,⑤銀染色： 聚丙烯凝膠電泳后，10%冰醋酸固定 20min

45、,雙蒸餾水洗 2min 3次。染色液（AgNO3lg/l,37% HCOH 1.5ml/l）中浸泡30min,雙蒸水洗15S，在顯色液（Na2CO3 30g/l,37%HCOH 0.5 ml/l Na2S2O3 5H2O 2mg/l ）中浸泡2-5min，加10%冰醋酸終止 10min，觀(guān)察結(jié)果。,2 、 Yashima等提出用存檔的石蠟病理標(biāo)本以原位雜交的方法測(cè)定人類(lèi)端粒酶RNA（human telonerase RNA, hTR）使

46、得回顧性研究端粒酶活性與預(yù)后的關(guān)系成為可能，但是Avilion等報(bào)告的一組資料發(fā)現(xiàn)hTR在端粒酶陽(yáng)性的所有病例中都表達(dá)，而在一些端粒酶陰性的病例中也有表達(dá)，hTR與端粒酶活性并不完全吻合，所以可能認(rèn)為hTR可能不是預(yù)測(cè)端粒酶活性好的指標(biāo)。,九、端粒酶與腫瘤治療 由于端粒酶活性見(jiàn)于絕大多數(shù)惡性腫瘤，而人正常體細(xì)胞（生殖細(xì)胞、造血干細(xì)胞等除外）中未見(jiàn)該酶活性，使得端粒、端粒酶已成為當(dāng)今最引人注目的抗瘤治療新靶點(diǎn)。

47、 應(yīng)用端粒酶的拮抗劑，治療具有端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞，限制其細(xì)胞壽命，最終導(dǎo)致細(xì)胞的特異性凋亡，這已成為癌癥治療學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)。抑制端粒酶活性是否會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，而達(dá)到治療腫瘤的目的呢？,目前有2個(gè)思路： ① Greider和Blackburn提出的利用反義寡核苷酸取代四膜蟲(chóng)端粒酶模板區(qū)（hTR），從而阻斷端粒酶活性。根據(jù)端粒酶含有的RNA是延長(zhǎng)端粒酶模板的特點(diǎn)以阻斷RNA模板，作為抑制端?；钚缘闹委煱?/p>

48、點(diǎn)。 ② 使端粒酶DNA發(fā)生突變，突變型的端粒酶與野生型的端粒酶競(jìng)爭(zhēng)端粒酶蛋白，導(dǎo)致合成錯(cuò)誤的端粒序列使端粒喪失功能，并能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。,主要有以下幾方面的對(duì)策 1、阻斷端粒酶RNA的模板作用對(duì)端粒酶活性的抑制： ① 反義核苷酸、反義肽苷酸及硫代反義核苷酸對(duì)端粒酶活性的抑制，這是一些極有發(fā)展前途的癌癥治療新藥。 ② 核酶對(duì)端粒酶活性的抑制，核酶是具有特殊核酸內(nèi)切酶活性的小分子RN

49、A。Kanazawa等設(shè)計(jì)了一種錘型的核酶（Telo-R2）具有特異性的切割hTR模板區(qū)的功能。核酶有望成為廣譜，低毒，高效的抗癌新藥。,2、核苷類(lèi)似物對(duì)端粒酶活性的抑制 ① 底物抑制作用，即核苷類(lèi)似物與端粒酶活性位點(diǎn)結(jié)合，形成失活的端粒酶-核苷復(fù)合物，從而抑制酶活性。 ② 核苷類(lèi)似物摻入端粒DNA中，形成不穩(wěn)定的DNA-端粒酶RNA復(fù)合物，或因構(gòu)象改變而導(dǎo)致合成中的端粒DNA從端粒酶中解離。

50、 ③ 7-脫氮-dNTP阻礙鳥(niǎo)嘌呤四聚體等二級(jí)結(jié)構(gòu)形成，導(dǎo)致端粒合成受阻。,3、細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑對(duì)端粒酶活性的抑制，正常人類(lèi)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)分化，端粒酶活性受到抑制，是否永生的腫瘤細(xì)胞也可通過(guò)誘導(dǎo)其分化而抑制其端粒酶活性呢？具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 部分腫瘤細(xì)胞有較長(zhǎng)的端粒（>10kb）,隨細(xì)胞有絲分裂，端?？s短是個(gè)緩慢的過(guò)程，這種情況下端粒酶抑制劑是否有效尚待進(jìn)一步證實(shí)。,端粒作為腫瘤的治療新靶點(diǎn)，目前已逐漸被重視

51、起來(lái)，但是，研究過(guò)程中也出現(xiàn)一些尚未解決的問(wèn)題。在一些腫瘤細(xì)胞株中沒(méi)有酶活性的表達(dá)，提示可能有非端粒酶介導(dǎo)的端粒長(zhǎng)度控制途徑，在臨床監(jiān)測(cè)中可能出現(xiàn)假陰性。另外，不同的瘤組織對(duì)不同的檢測(cè)手段敏感性不同，只有我們對(duì)不同腫瘤的特性有了更充分的認(rèn)識(shí)，才可找到更為專(zhuān)一敏感、可靠的檢測(cè)方法，一旦上述的矛盾問(wèn)題得以解決，腫瘤的臨床監(jiān)測(cè)與治療會(huì)取得突破性進(jìn)展，不僅如此，目前尚有研究證明端粒酶與其它一些疾病包括艾滋病都有一定相關(guān)性，可以預(yù)見(jiàn)，隨著研究的深

52、入，端粒酶將為多種疾病的診斷與治療提供快捷、特異、副作用小的檢測(cè)新途徑。,十、研究存在的問(wèn)題 端粒酶結(jié)構(gòu)與功能的辯明，對(duì)于深入理解細(xì)胞衰老，永生及癌變機(jī)制具有非常重要的指導(dǎo)作用。但是目前仍存在不少問(wèn)題，有待于解決。 ①端粒酶中RNA與蛋白質(zhì)在催化或底物結(jié)合中 的確切機(jī)制； ②模板RNA與DNA引物的作用途徑； ③人類(lèi)端粒酶蛋白的分離、克??；,④多數(shù)腫瘤端粒較短，端粒合成受抑后細(xì)胞可較快死亡。但少數(shù)端粒較長(zhǎng)的腫瘤中，