hTERT啟動子核心序列的克隆及其在端粒酶陽性肺癌細(xì)胞中的靶向轉(zhuǎn)錄活性研究.pdf

1、目的：克隆人端粒酶催化亞單位(hTERT)啟動子核心序列片段，并構(gòu)建hTERT啟動子調(diào)控的綠色熒光蛋白(GFP)基因表達(dá)質(zhì)粒，初步研究hTERT啟動子在肺癌細(xì)胞A549和正常人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5中的轉(zhuǎn)錄活性，以便為肺癌靶向性基因治療的研究奠定基礎(chǔ)。 方法： 1．以人胚腎293細(xì)胞(HEK293)基因組DNA為模板，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法，克隆具有轉(zhuǎn)錄活性的hTERT啟動子核心片段(238bp)，片段兩端含限

2、制性內(nèi)切酶SalⅠ、BglⅡ的酶切位點。 2．將克隆的hTERT啟動子核心序列片段插入無啟動子的含綠色熒光蛋白(GFP)基因的報告質(zhì)粒載體peGFP-1的多克隆位點中，構(gòu)建含hTETR啟動子調(diào)控的綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒peGFP-1-hTERT，并對其進(jìn)行序列測定。 3．用含有巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子的EGFP質(zhì)粒peGFP-N1作為陽性對照，peGFP-1作為陰性對照，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞A549和端粒酶陰性的

3、人胚肺成纖維細(xì)胞株MRC-5，熒光顯微鏡下觀察兩種細(xì)胞綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況，初步確定hTERT啟動子在上述肺癌細(xì)胞株和MRC-5細(xì)胞株中的轉(zhuǎn)錄活性。 結(jié)果： 1．PCR產(chǎn)物電泳鑒定，顯示克隆的DNA片段長約230-250bp，DNA測序結(jié)果與GeneBank中hTERT啟動子的堿基序列完全一致，長為238bp。 2．限制性內(nèi)切酶SalⅠ、BglⅡ雙酶切重組質(zhì)粒peGFP-1-hTERT，分別得到4.2k

4、b、238bp的片段，與peGFP-1和hTERT啟動子核心片段(238bp)的大小相吻合；以peGFP-1-hTERT。為模板，PCR擴(kuò)增出238bp大小DNA片段。 3．轉(zhuǎn)染陽性對照peGFP-N1質(zhì)粒的肺癌細(xì)胞A549和端粒酶陰性的人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5均有綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)；轉(zhuǎn)染peGFP-1-hTERT的肺癌細(xì)胞A549有GFP表達(dá)，而轉(zhuǎn)染peGFP-1-hTERT的MRC-5無GFP表達(dá)；轉(zhuǎn)染陰性對照pe

5、GFP-1的肺癌細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞均無GFP表達(dá)。 結(jié)論： 1．本課題成功克隆了長度為238bp的hTERT啟動子核心片段，并成功構(gòu)建含hTETR啟動子調(diào)控的綠色熒光蛋白(GFP)基因表達(dá)質(zhì)粒peGFP-1-hTERT； 2．hTERT啟動子在端粒酶陽性的肺癌細(xì)胞A549中有特異性的轉(zhuǎn)錄活性，而在人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5細(xì)胞中無轉(zhuǎn)錄活性： 3．hTETR啟動子能調(diào)控GFP在肺癌細(xì)胞中靶向性表達(dá)；CMV