人口腔鱗癌細(xì)胞中整合素β6基因啟動(dòng)子的克隆及轉(zhuǎn)錄活性研究.pdf

1、研究目的:
　　鑒定ITGB6基因5’側(cè)翼主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域,探討調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞中ITGB6基因基本轉(zhuǎn)錄活性的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件及轉(zhuǎn)錄因子。
　　材料和方法:
　　利用生物信息學(xué)方法預(yù)測ITGB6基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn)及5’側(cè)翼主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域。利用PCR方法從口腔鱗癌細(xì)胞中擴(kuò)增ITGB6基因5’側(cè)翼區(qū),構(gòu)建含有ITGB6基因5’側(cè)翼區(qū)不同長度片斷的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞人胚腎細(xì)胞293T和HEK2

2、93檢測熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒啟動(dòng)子活性,進(jìn)一步轉(zhuǎn)染人口腔鱗癌細(xì)胞株TCA8113和SAS,檢測ITGB6基因5’側(cè)翼區(qū)不同長度片斷在口腔鱗癌細(xì)胞中的活性,確定調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞中ITGB6基因基本轉(zhuǎn)錄活性的主要調(diào)控區(qū);利用生物信息學(xué)方法并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)預(yù)測調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞ITGB6基因基本轉(zhuǎn)錄活性的可能順式作用元件及與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子;利用定點(diǎn)突變、凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)和染色質(zhì)免疫共沉淀方法確定調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞ITGB6基因基本轉(zhuǎn)錄活性的主要順

3、式作用元件及與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。
　　結(jié)果:
　　1.生物信息學(xué)預(yù)測ITGB6基因主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件位于5’側(cè)翼區(qū)-946/+167區(qū)域,轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于翻譯起始位點(diǎn)上游166bp。
　　2.成功構(gòu)建5個(gè)ITGB6基因5’側(cè)翼區(qū)不同長度片斷熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,分別命名為pGL2-B6(-946/+172),pGL2-B6(-458/+172),pGL2-B6(-187/+172),pGL2-B6(-35/+172)和p

4、GL2-B6(+22/+172)。
　　3.ITGB6基因5’側(cè)翼區(qū)不同長度片斷熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)?；締?dòng)子活性分析:重組報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染分別293T和HEK293細(xì)胞,當(dāng)ITGB6基因5’側(cè)翼區(qū)序列從-946截短到-458時(shí),啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性均顯著性增加,分別為52.50％,61.25%;-458截短到-187時(shí),啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性均顯著性降低,分別為65.09%,88.51%;當(dāng)-35截短到+22時(shí),啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性幾乎完全喪失;而

5、-187截短到-35時(shí),啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性差異無統(tǒng)計(jì)意義。
　　4.口腔鱗癌細(xì)胞中ITGB6基因基本轉(zhuǎn)錄活性主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的定位分析:口腔鱗癌細(xì)胞中,ITGB6基因5’側(cè)翼片斷-458/+172具有最強(qiáng)的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性;當(dāng)ITGB6基因5’側(cè)翼區(qū)序列逐漸截短時(shí),啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性呈逐漸降低趨勢(shì),其中從-458截短到-187時(shí),啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的降低幅度最大;從-35截短到+22時(shí),啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性幾乎完全喪失。接著,我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在口腔鱗癌細(xì)

6、胞中當(dāng)ITGB6基因5’側(cè)翼區(qū)序列的-458截短到-326時(shí),啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性無顯著性差異;當(dāng)ITGB6基因5’側(cè)翼區(qū)序列從-326截短到-187,啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性在兩種口腔鱗癌細(xì)胞株中均顯著下降。提示ITGB6基因在口腔鱗癌細(xì)胞中的基本轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控區(qū)主要位于ITGB6基因5’側(cè)翼區(qū)序列的-326～-187區(qū)域和-35~+22。
　　生物信息學(xué)分析顯示ITGB6基因-326～-187區(qū)域具有Stat3、SRF、C-MYB、CEBPα(

7、CEBP)、AP-1和YY-1等轉(zhuǎn)錄因子潛在的結(jié)合位點(diǎn);進(jìn)一步利用定點(diǎn)突變技術(shù),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子SRF、Stat3和CEBP等的潛在的結(jié)合位點(diǎn)可能涉及口腔鱗癌中ITGB6基因基本轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控。
　　而在-35~+22區(qū)域,生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)具有Oct-1、IRF-4和TBP等轉(zhuǎn)錄因子潛在的結(jié)合位點(diǎn),進(jìn)一步利用定點(diǎn)突變技術(shù),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子TBP的潛在的結(jié)合位點(diǎn)可能涉及口腔鱗癌中ITGB6基因基本啟動(dòng)子活性的調(diào)控。
　　5.口腔鱗癌細(xì)

8、胞中參與調(diào)控ITGB6基因基本轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄因子的鑒定分析:凝膠遷移變動(dòng)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示含有SRF,CEBP,Stat3結(jié)合位點(diǎn)序列的探針與TCA8113細(xì)胞核抽提物均發(fā)生遷移阻滯;染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示,在TCA8113細(xì)胞中,SRF,CEBP,Stat3三種轉(zhuǎn)錄因子和ITGB6啟動(dòng)子-326～-187區(qū)域在TCA8113細(xì)胞中有體內(nèi)結(jié)合,而轉(zhuǎn)錄因子TBP結(jié)合在-35~+22區(qū)域。
　　結(jié)論:
　　1.口腔鱗癌細(xì)胞中,-

9、326～-187區(qū)域和-35~+22區(qū)域是ITGB6基因基本轉(zhuǎn)錄活性的主要調(diào)控區(qū)。ITGB6基因5’側(cè)翼區(qū)具有典型的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的特點(diǎn),其中-326/-187區(qū)域是ITGB6啟動(dòng)子調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子區(qū)域,-35~+22區(qū)域是ITGB6核心啟動(dòng)子區(qū)域,-946/-458區(qū)域是遠(yuǎn)距離調(diào)控元件區(qū)域。
　　2.轉(zhuǎn)錄因子SRF、CEBP、Stat3和TBP參與在口腔鱗癌細(xì)胞中ITGB6基因基本轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控,其中SRF、CEBP和Stat3結(jié)合