舌癌耐藥相關(guān)基因TCRP1啟動(dòng)子克隆及轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究.pdf

1、背景與目的:舌癌是口腔頜面部最常見(jiàn)的惡性腫瘤,臨床常規(guī)采用手術(shù)為主并輔以放、化療的綜合治療方法。由于化療易產(chǎn)生耐藥性且其機(jī)制尚未闡明,影響了舌癌的治療效果。TCRP1基因是我室采用EST介導(dǎo)的定位候選克隆策略從舌癌多藥耐藥細(xì)胞(Tca8113/pym)中克隆的一個(gè)舌癌耐藥相關(guān)基因,體內(nèi)外研究已初步證實(shí)TCRP1基因能特異性介導(dǎo)舌癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐受。但TCRP1基因啟動(dòng)子序列及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制尚不明確。本課題將在克隆TCRP1基因啟動(dòng)子、預(yù)測(cè)

2、轉(zhuǎn)錄因子的基礎(chǔ)上圍繞基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律開(kāi)展相關(guān)研究,為闡述TCRP1基因在舌癌耐藥中的作用機(jī)制提供新的理論依據(jù)。
　　 方法:(1)生物信息學(xué)分析TCRPl基因5’端調(diào)控區(qū),預(yù)測(cè)TCRP1基因候選啟動(dòng)子區(qū)及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),構(gòu)建系列缺失片段熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染舌癌細(xì)胞,檢測(cè)熒光素酶活性,確定TCRP1基因啟動(dòng)子區(qū)域;(2)生物信息學(xué)分析能與TCRP1基因啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子及其位點(diǎn),對(duì)預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子c-Myc采用染色質(zhì)免疫沉

3、淀實(shí)驗(yàn)(CHIP)驗(yàn)證:(3)將c-Myc與TCRP1啟動(dòng)子報(bào)告載體pGL4+322/+709共轉(zhuǎn)染至Tca8113細(xì)胞中,或在Tca8113/PYM細(xì)胞中轉(zhuǎn)入pGL4+322/+709,再針對(duì)c-Myc進(jìn)行抑制劑處理或RNA干擾后,通過(guò)熒光素酶活性分析檢測(cè)c-Myc對(duì)TCRP1啟動(dòng)子活性的影響;(4)Western Blot檢測(cè)Tca8113與Tca8113/PYM細(xì)胞中c-Myc的表達(dá)差異;將c-Myc轉(zhuǎn)入Tca8113細(xì)胞,或在T

4、ca8113/PYM細(xì)胞對(duì)c-Myc進(jìn)行抑制劑處理或RNA干擾后,采用RT-PCR、Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中TCRP1表達(dá)的變化,MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥性的改變。
　　 結(jié)果:(1)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)TCRP1基因啟動(dòng)子位于-939bp至+700bp區(qū)域,且存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)確定TCRP1基因5'端+322/+709區(qū)間為其啟動(dòng)子所在區(qū)域,且在Tca8113/PYM細(xì)胞中的啟動(dòng)活性高于Tca8

5、113細(xì)胞;(2)生物信息學(xué)分析TCRP1基因啟動(dòng)子區(qū)為一不含TATA盒與CAAT盒的GC富集區(qū),并含有AP2,ADR1,Sp1,NF-1,RAF和c-Myc等多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),CHIP實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)錄因子c-Myc能與TCRP1基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合;(3)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)c-Myc可上調(diào)TCRP1基因啟動(dòng)子活性;(4)c-Myc在Tca8113/PYM細(xì)胞中的表達(dá)比Tca8113細(xì)胞高;c-Myc外源性高表達(dá)細(xì)胞(Tca8113/

6、c-Myc)中TCRP1 mRNA與蛋白表達(dá)增加,細(xì)胞對(duì)順鉑耐受增強(qiáng);c-Myc表達(dá)沉默細(xì)胞(Tca8113/PYM-I)中TCRP1 mRNA與蛋白表達(dá)降低,細(xì)胞對(duì)順鉑耐受降低。
　　 結(jié)論:(1)TCRP1基因的啟動(dòng)子位于其5'端+322/+709區(qū)域;(2)TCRP1基因啟動(dòng)子是一個(gè)不含TATA盒與CAAT盒的GC富集區(qū),并含有AP2,ADR1,Sp1,NF-1,RAF和c-Myc等多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn);(3)轉(zhuǎn)錄因子c-