NFBD1啟動(dòng)子克隆、鑒定、轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制及其在細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡中的作用研究.pdf

1、NFBD1(Nuclear Factor with BRCT Domains Protein 1)，也稱(chēng)MDC1(Mediator of DNA Damage Checkpoint Protein 1)，是一個(gè)參與細(xì)胞內(nèi)DNA損傷后細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的重要分子。我們研究小組在前期曾發(fā)現(xiàn)NFBD1在DNA損傷后出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄下調(diào)并通過(guò)和P53互作而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，但NFBD1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制仍不清楚，同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果也提示NFBD1很可能參與細(xì)胞生長(zhǎng)凋亡等的

2、調(diào)節(jié)。本論文即在此基礎(chǔ)上，對(duì)NFBD1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)凋亡的功能進(jìn)行了相對(duì)系統(tǒng)的研究。分述如下： (1)NFBD1啟動(dòng)子的克隆、鑒定與初步分析：首先應(yīng)用5’RACE技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析鑒定了NFBD1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，首次發(fā)現(xiàn)NFBD1至少存在4種豐度和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)不同的轉(zhuǎn)錄剪接變異體。然后采用PCR定向克隆和酶切亞克隆策略，構(gòu)建了覆蓋NFBD1基因5’側(cè)翼區(qū)起始密碼子ATG上游5kb區(qū)域的一系列NFBD1啟動(dòng)子熒光素

3、酶報(bào)告基因重組體。啟動(dòng)子活性分析表明，NFBD1主要啟動(dòng)子區(qū)域定位于其主要轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域附近1.5 kb的區(qū)域內(nèi)，同時(shí)在其上游還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)活性較低的啟動(dòng)子。采用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析軟件分析表明，NFBD1啟動(dòng)子缺乏TATA盒，但含有典型的CCAAT盒和GC盒以及其它潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，提示Sp1和NF-Y等轉(zhuǎn)錄因子可能參與NFBD1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。 (2)NFBD1核心啟動(dòng)子區(qū)域的鑒定與分析：針對(duì)已經(jīng)初步鑒定的NFBD1主

4、要啟動(dòng)子區(qū)域，進(jìn)一步采用限制性酶切聯(lián)合DNA blunting方法構(gòu)建NFBD1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因系列刪除體。啟動(dòng)子活性分析表明，NFBD1核心啟動(dòng)子區(qū)域定位于其主要轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域附近325 bp的區(qū)域內(nèi)，該區(qū)域分別包含有兩個(gè)高度保守的Sp1和NF-Y結(jié)合位點(diǎn)，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)保守的STAT1結(jié)合位點(diǎn)。ChIP和EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Sp1和NF-Y可以與NFBD1啟動(dòng)子在體外(in vitro)和細(xì)胞內(nèi)(in vivo)結(jié)合，而STA

5、T1則不與該NFBD1啟動(dòng)子結(jié)合。定點(diǎn)突變分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NFBD1核心啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)NF-Y結(jié)合位點(diǎn)的突變對(duì)NFBD1啟動(dòng)子活性沒(méi)有明顯影響，但Sp1結(jié)合位點(diǎn)的突變導(dǎo)致NFBD1啟動(dòng)子活性的消失，提示Sp1可能在NFBD1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著更為重要的作用。 (3)NFBD1的DNA損傷后轉(zhuǎn)錄下調(diào)機(jī)制研究：采用阿霉素處理A549或HeLa細(xì)胞建立DNA損傷細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)阿霉素處理后細(xì)胞內(nèi)NFBD1 mRNA和蛋白質(zhì)水平顯著降低，而

6、Sp1的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。磷酸酶處理實(shí)驗(yàn)表明，阿霉素處理后Sp1出現(xiàn)磷酸化修飾，同時(shí)ChIP實(shí)驗(yàn)表明，阿霉素處理導(dǎo)致Sp1與NFBD1啟動(dòng)子的結(jié)合活性降低。NFBD1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因系列刪除體分析實(shí)驗(yàn)表明，Sp1參與DNA損傷后的NFBDl轉(zhuǎn)錄下調(diào)。Sp1的特異性抑制劑光輝霉素A處理和siRNA介導(dǎo)的Sp1表達(dá)抑制導(dǎo)致NFBD1啟動(dòng)子活性和內(nèi)源性NFBD1 mRNA和蛋白質(zhì)水平的降低，同時(shí)，siRNA介導(dǎo)的Sp1表達(dá)抑制也提高

7、了細(xì)胞對(duì)化療藥物阿霉素的敏感性。這些結(jié)果表明，Sp1介導(dǎo)DNA損傷后NFBD1的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，這在DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)中起著重要的作用。 (4)STAT1在NFBD1轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用研究：半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DNA損傷后NFBD1出現(xiàn)明顯的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，STAT1mRNA水平明顯升高，其相應(yīng)靶基因也同時(shí)出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活或抑制。但蛋白質(zhì)印跡分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DNA損傷后STAT1蛋白質(zhì)水平僅呈現(xiàn)輕微升高，且STAT1的磷酸化修飾和轉(zhuǎn)

8、位/移位情況沒(méi)有明顯變化。雖然STAT1抑制劑氟達(dá)拉濱處理非特異性地顯著降低了NFBD1的啟動(dòng)子活性和mRNA水平，但I(xiàn)FNγ處理誘發(fā)的內(nèi)源性STAT1激活和siRNA介導(dǎo)的STAT1表達(dá)抑制對(duì)NFBD1的啟動(dòng)子活性和mRNA水平?jīng)]有明顯影響。這些結(jié)果表明，STAT1不參與NFBD1的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控。 (5)NFBD1在細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡中的作用研究：半定量RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，篩選到的短鏈NFBD1 siRNA可

9、以成功抑制內(nèi)源NFBD1的表達(dá)，抑制率幾乎100％。對(duì)HeLa等細(xì)胞進(jìn)行NFBD1 siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)NFBD1 siRNA可以顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。FACS分析和蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果表明，NFBD1 siRNA可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA損傷的累積、G2/M期檢測(cè)點(diǎn)的激活和G2/M期停滯。采用細(xì)胞同步化技術(shù)，制備不同細(xì)胞周期時(shí)相的樣品，進(jìn)行NFBD1的基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)NFBD1在G2/M期表達(dá)水平升高，在G1、S期表達(dá)水平降低，表明NFB

10、D1為-G2/M期基因，并參與細(xì)胞周期進(jìn)程或調(diào)控。 FACS分析結(jié)果表明，NFBD1 siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染導(dǎo)致sub-G1峰的出現(xiàn)，同時(shí)蛋白質(zhì)印跡分析觀察到了Caspase 3和PARP的剪接激活，表明NFBD1 sieNA誘發(fā)了細(xì)胞凋亡。另外蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果還表明，該凋亡過(guò)程中P53及其下游靶分子bax和puma也沒(méi)有明顯變化，但noxa在mRNA和蛋白質(zhì)水平上均顯著升高，強(qiáng)烈提示P53非依賴(lài)性的Noxa轉(zhuǎn)錄激活可能在NFBD

11、1 siRNA誘發(fā)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著重要作用。另外，MTT分析結(jié)果也表明，NFBD1 siRNA顯著提高了細(xì)胞對(duì)阿霉素、順鉑等化療藥物的敏感性。這些結(jié)果表明，作為一新的G2/M期基因，NFBD1不僅參與正常的細(xì)胞生長(zhǎng)，而且參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過(guò)程；NFBD1也是一個(gè)有效的放化療增敏劑藥物和基因治療藥物靶點(diǎn)。 本論文對(duì)NFBD1轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)凋亡的分子功能的系統(tǒng)研究進(jìn)一步加深了我們對(duì)NFBD1分子功能和分子行為機(jī)制的認(rèn)識(shí)，