人腸三葉因子啟動(dòng)子的克隆及轉(zhuǎn)錄活性分析.pdf

1、研究背景:腸三葉因子(intestinal trefoil factor,ITF)是含有59個(gè)氨基酸殘基的單鏈多肽[1],分子量為6.7kD,其核心的38～39個(gè)氨基酸殘基中包含6個(gè)半胱氨酸,形成3對(duì)鏈內(nèi)二硫鍵,產(chǎn)生特征性三葉形結(jié)構(gòu),并因此而得名[10]。研究表明,ITF是具有潛在藥用價(jià)值的小分子多肽,能減輕各種致傷因素導(dǎo)致的粘膜損傷,促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖、移行,從而啟動(dòng)受損腸粘膜修復(fù),促進(jìn)粘膜屏障重建[3]。發(fā)現(xiàn)ITF已十余年,人們對(duì)I

2、TF進(jìn)行了多方面的深入研究,包括組織分布、基因定位、重組表達(dá)、理化性質(zhì)、抗體制備、氨基酸序列分析、空間結(jié)構(gòu)確證以及大量的功能學(xué)研究等[10]。但對(duì)ITF表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究還不夠深入,特別是在生理狀況下如何維持ITF的高表達(dá)還不甚清楚。Seib.T首先擴(kuò)增了人腸三葉因子(human trefoil factor,hITF)的啟動(dòng)子區(qū)序列[6],預(yù)測(cè)期間存在多個(gè)AP-1和Sp1調(diào)控元件。隨后又發(fā)現(xiàn)了多個(gè)元件如缺氧誘導(dǎo)因子反應(yīng)元件(hypox

3、ia inducible factorl resposnse element,HRE)、丁酸反應(yīng)元件(butyrateresponse element,BRE)等,這些元件在外界因素刺激下能調(diào)控hITF的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[7]。Iwakiri等報(bào)道了在鼠類ITF啟動(dòng)子區(qū)有杯狀細(xì)胞反應(yīng)元件(goblet cell responseelement,GCRE)及杯狀細(xì)胞沉默子抑制子(goblet cell silencer inhibitor,GC

4、SI)[8][9],他們能單獨(dú)或與其他正性反應(yīng)元件協(xié)同,促進(jìn)ITF轉(zhuǎn)錄,確保ITF的特異性高表達(dá)。hITF啟動(dòng)子中是否也有類似元件還不甚清楚,有學(xué)者曾預(yù)測(cè)在hITF啟動(dòng)子上游存在同源元件,但未進(jìn)行驗(yàn)證,關(guān)于這個(gè)問(wèn)題目前尚無(wú)定論。
　　 研究目的:通過(guò)對(duì)hITF啟動(dòng)子的克隆和轉(zhuǎn)錄活性分析,探索hITF特異性高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 1.基因組DNA提取
　　 按試劑盒E.Z.N.A.(

5、R)Tissue DNA kit說(shuō)明書(shū)操作,從3×106個(gè)LS-174T細(xì)胞中提取人基因組DNA,去離子水溶解,經(jīng)0.6％瓊脂糖凝膠電泳后鑒定片段大小、完整性及純度。
　　 2.構(gòu)建hITF啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告載體
　　 ①引物設(shè)計(jì)
　　 從EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中查找含hITF的基因序列AB038162,以此為模板用primer3網(wǎng)上引物設(shè)計(jì)平臺(tái)(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)設(shè)計(jì)引物

6、,Tm值設(shè)定為60～68℃,上游引物添加MluⅠ酶切位點(diǎn)及3個(gè)保護(hù)堿基,下游引物添加X(jué)hoⅠ或HindⅢ酶切位點(diǎn)及2～3個(gè)保護(hù)堿基。
　　 ②PCR擴(kuò)增hITF啟動(dòng)子片段
　　 以人基因組DNA為模板,KOD-Plus高保真酶擴(kuò)增啟動(dòng)子片段,Ta值設(shè)定為60～68℃,30～35個(gè)循環(huán)。
　　 ⑧克隆至pGL-3 basic熒光素酶報(bào)告載體
　　 PCR產(chǎn)物純化回收后用MluⅠ與XhoⅠ(HindⅢ)雙酶切

7、,同時(shí)雙酶切pGL-3basic質(zhì)粒,膠回收后用T4 DNA連接酶以3～2:1比例連接克隆片段和質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)挑取陽(yáng)性克隆,雙酶切鑒定正確后測(cè)序。
　　 3.轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞或LS-174T細(xì)胞檢測(cè)熒光素酶報(bào)告活性
　　 ①細(xì)胞擴(kuò)增及種植
　　 HEK-293及LS-174T細(xì)胞用含10％牛血清DMEM培養(yǎng)基放37℃5％CO2孵箱中培養(yǎng),長(zhǎng)至80～90％密度后用含10％牛血清DMEM培養(yǎng)基接種于2

8、4孔板中,密度約70～80％,過(guò)夜培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁牢固后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
　　 ②轉(zhuǎn)染
　　 轉(zhuǎn)染前換用不含牛血清的DMEM培養(yǎng)基,每孔0.5ml,各質(zhì)粒按照等摩爾比進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染試劑jetPEI與質(zhì)粒按2μl:1μg比例進(jìn)行換算,轉(zhuǎn)染后6小時(shí)換液,轉(zhuǎn)染后48小時(shí)裂解細(xì)胞并檢測(cè)熒光素酶活性。
　　 ③統(tǒng)計(jì)分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行單因素方差分析,P＜0.05視為差異顯著。
　　 研究結(jié)果:

9、
　　 1.通過(guò)PCR擴(kuò)增hITF基因-2331/+79區(qū)域,并成功構(gòu)建了pGL-3 hITFpro-2500(-2331/+79)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,該質(zhì)粒在LS-174T及HEK-293細(xì)胞中活性較低。
　　 2.對(duì)-2331/+79片段活性較低進(jìn)行分析后,預(yù)測(cè)在外顯子1中的+53/+79區(qū)域有抑制性元件存在,構(gòu)建的Vx2.5(-2331/+53)質(zhì)?；钚悦黠@增加,提示+53/+79區(qū)域具有抑制作用。對(duì)+53/+179

10、區(qū)域以6bp為單位進(jìn)行替換突變,mut1、mut2、mut3、mut4突變體活性均大幅上升,表明整個(gè)+53/+79區(qū)域都具有強(qiáng)抑制作用。結(jié)合文獻(xiàn)分析此區(qū)域可能是抑制轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在2號(hào)外顯子中的hITF異構(gòu)體的轉(zhuǎn)錄,從而維持具有生物活性的野生型ITF的表達(dá)。
　　 3.根據(jù)第二部分結(jié)果發(fā)現(xiàn)在剔除了+53/+79區(qū)域后,Vx2.5活性上升,隨后構(gòu)建的-2.0,-1.5,-1.0,-0.5kb都以+53為3'端截止位點(diǎn),各片段活性較高

11、且接近一致。進(jìn)一步截短發(fā)現(xiàn)-300bp與-200bp之間差異活性顯著,細(xì)化分區(qū)表明-280bp與-260bp片段活性差異明顯。結(jié)合alibaba2軟件預(yù)測(cè)明確了正性元件的初步位置位于-280/-251區(qū)域,針對(duì)此區(qū)域的-278/-270及-266/-256兩個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn)分別進(jìn)行替換突變,mutMIX1和mut Sp1②突變載體活性大幅下降,為突變前的20～25％。最終明確在-278/-270及-266/-256的兩個(gè)Sp1位點(diǎn)對(duì)hI