hTERT基因啟動子調(diào)控靶向自殺基因治療喉癌的研究.pdf

1、目的：研究人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因核心啟動子調(diào)控的人單純皰疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韋(HSV-tk/GCV)系統(tǒng)對喉癌細胞的特異性殺傷作用及對喉癌動物模型抑瘤率的影響，為解決喉癌基因治療中非特異性殺傷問題提供新思路。 方法： (1)PCR擴增hTERT啟動子與tk基因，回收擴增產(chǎn)物并插入pCI-neo載體，構(gòu)建分別由hTERT啟動子和CMV啟動子調(diào)控的tk基因真核表達載體pCI/hTERT-tk和pCI/tk

2、。 (2)分別用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染喉癌細胞Hep-2和正常血管內(nèi)皮細胞ECV304，新霉素(G418)篩選陽性克隆擴增。用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)比較兩種細胞tk基因的表達情況；給予前藥更昔洛韋(GCV)，MTT法檢測72h細胞存活情況；同時用細胞凋亡原位檢測(TUNEL)法、流式細胞術(shù)以及電鏡觀察檢測細胞凋亡情況。 (3)Hep-2細胞接種裸鼠，分為三組：高劑量實驗組(pCI/hTERT-tk質(zhì)粒DNA，瘤內(nèi)注射，

3、120μg/只)；低劑量實驗組(pCI/hTERT-tk質(zhì)粒DNA，瘤內(nèi)注射，40μg/只)；脂質(zhì)體對照組(脂質(zhì)體，瘤內(nèi)注射，100μL/只)。成瘤后腹腔注射GCV，每兩天測量皮下移植瘤長、寬徑，繪制腫瘤生長曲線。24天后處死裸鼠，稱取瘤重，計算瘤重抑制率。 結(jié)果： (1)酶切及測序證實成功克隆hTERT基因啟動子，成功構(gòu)建了攜帶有hTERT基因啟動子的pCI/hTERT-tk真核表達載體。 (2)hTERT啟動

4、子調(diào)控下的HSV-tk/GCV系統(tǒng)對Hep-2細胞有明顯的殺傷作用，使43.1％的Hep/hTERT-tk細胞凋亡；而對正常細胞ECV304作用則不明顯。TUNEL檢測可見Hep/hTERT-tk細胞核內(nèi)出現(xiàn)凋亡特征性陽性染色，電鏡下觀察可見核固縮、染色質(zhì)聚集、凋亡小體產(chǎn)生等凋亡表現(xiàn)，而對照組ECV304細胞無此現(xiàn)象。 (3)動物實驗中，高劑量實驗組和低劑量實驗組瘤重抑制率可達72.1％和48.2％，顯著高于對照組，且兩組間差異