鼻咽癌中EBNA1基因和Q啟動子突變的功能學(xué)研究.pdf

1、1.研究背景與目的： 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國南方、東南亞以及南非的一些地區(qū)常見的一種惡性腫瘤，因為其獨特的流行病學(xué)、病理學(xué)、臨床表現(xiàn)、治療和預(yù)后以及與EB病毒(Epstein—BarrVirus)緊密相關(guān)等特征而有別于其他的頭頸癌。目前，雖然鼻咽癌的病因?qū)W機制還未被完全闡明，但是其發(fā)病率的地理分布特征提示了該疾病的發(fā)生可能是環(huán)境和遺傳因素相互作用的結(jié)果，其發(fā)生發(fā)展可能涉及到基因易

2、感性、環(huán)境危險因素、特定飲食習慣和EB病毒(Epstein—BarrVirus，EBV)感染及突變等因素。EB病毒(Epstein—BarrVirus，EBV)是一種含173kbDNA基因組的人類γ—皰疹病毒，EB病毒的感染在世界范圍內(nèi)十分普遍，90％以上的個體被EB病毒感染，但并不引起癥狀，而是潛伏于宿主外周血B淋巴細胞中并可持續(xù)終生。 EB病毒編碼的核抗原1(EBNA1)是唯一的在所有增值感染細胞中持續(xù)表達的蛋白；以同二聚體

3、的形式直接結(jié)合到EB病毒DNA潛伏復(fù)制起始區(qū)(oriP)內(nèi)的特異性識別位點上，在EB病毒潛伏感染中起多種重要作用，包括：啟動EB病毒DNA的復(fù)制、EB病毒基因組的有絲分裂、其他EB病毒潛伏蛋白的轉(zhuǎn)錄激活等。EB病毒DNA的復(fù)制開始于含有4個EBNA1結(jié)合位點的oriP的二重對稱原件(DS)內(nèi)。EB病毒附加體的分離需要EBNA1結(jié)合到oriP內(nèi)含有20個EBNA1結(jié)合位點的重復(fù)序列家族(FR)元件上。FR還足EBNA1激活的潛伏膜蛋白啟動

4、子和Q啟動子的增強子。EBNA1蛋白也自動調(diào)節(jié)Ⅰ型潛伏感染時啟動EBNA1表達的Qp啟動子。EBNA1蛋白有641個氨基酸殘基組成，能夠被分成N—末端(1-89氨基酸殘基)和C—末端(328-641氨基酸殘基)結(jié)構(gòu)域，中間的甘氨酸—丙氨酸殘基短鏈重復(fù)序列(GAR)將兩末端結(jié)構(gòu)隔開。EBNA1蛋白上介導(dǎo)與DNA結(jié)合和形成二聚體的殘基定位在C—末端的459-607為氨基酸殘基之間；1-89位和322-379位氨基酸殘摹互相協(xié)調(diào)共同介導(dǎo)病毒基

5、因組以附加體的形式連接細胞染色體上并持續(xù)存在和激活轉(zhuǎn)錄的基本機構(gòu)，然而，379-386位氨基酸殘基是核定位序列，605-641位氨基酸殘基的肽段存在一個酸性激活的結(jié)構(gòu)域。根據(jù)EBNA1蛋白第487位氨基酸的變異，將其分為五種亞型，其中兩種為原型(prototype，p—)，三種為變異型(variant，v—)，即P—ala，P—thr，V—val，V—leu和V—pro。有報道稱V—val型EBNA1與鼻咽癌的感染密切相關(guān)，在20例中國

6、人鼻咽癌活檢標本中檢測到的EBNA1全部是V—va型。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)96.55％(84/87)鼻咽癌標本有只含單一的V—val型EBNA1基因；然而，通過對EB病毒健康攜帶者外周血單個核細胞DNA的檢測發(fā)現(xiàn)在健康人外周血中77.08％(111/144)是V—val型、P—ala型和(或者)V—thr型EBNA1的混合型。因此我們有理由推測V—val型EBNA1在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中比其它亞型EBNA1更有優(yōu)勢。我們分析比較了V—val

7、型和原型EBNA1測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，絕大部分V—val型EBNA1的突變都導(dǎo)致了重要功能區(qū)內(nèi)的實際氨基酸殘基的改變，這很可能導(dǎo)致V—val型EBNA1在生物學(xué)功能上與原型明顯不同。我們課題組先前的研究證明V—val突變型EBNA1蛋白與原型EBNA1蛋白之間在功能學(xué)上有重要差異：我是通過將V—val突變型和P—ala原型EBNA1基因分別克隆至pGFP—C2載體上并在293細胞中表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含V—val型EBNA1蛋白具有更強的轉(zhuǎn)錄活性和

8、維持宿主細胞存活的能力。 EBNA1的表達在Ⅰ型和Ⅱ型潛伏中則由Q啟動子(Qp)啟動，因此鼻咽癌中的EBNA1蛋白的表達由Qp啟動子啟動。與細胞管家基因的啟動子相似，Qp的TATA序列含量少，主要靠富含CpG序列的啟動元件發(fā)揮作用，其活性受普遍存在的細胞轉(zhuǎn)錄因子Sp1的調(diào)控，Qp的CpG島通過與不受甲基化影響的細胞因子(如Sp1等)結(jié)合來使自身處于未甲基化狀態(tài)。CpG序列在EB病毒基因表達調(diào)控中起非常重要的作用，甲基化狀態(tài)是其表

9、達調(diào)控的機制之一。 本課題為了進一步確定V—val突變型EBNA1蛋白在功能上的優(yōu)勢以及導(dǎo)致這種優(yōu)勢的相關(guān)變化的區(qū)域；我們構(gòu)建了一批EBNA1的表達克隆，包括：pp—EBNA1(N端和C端均未突變)、pv—EBNA1(N端未突變C端突變)、vp—EBNA1(N端突變C端未突變)和vv—EBNA1(N端和C端均突變)，此外我們還構(gòu)建了含F(xiàn)R序列的報告質(zhì)粒：采用Westernblotassay、Reporterassays和Elec

10、trophoreticmobilityshiftassay等方法探測不同突變型EBNA1蛋白同F(xiàn)R的親和力和轉(zhuǎn)錄活性強弱。 另外，鼻咽癌中EB病毒潛伏感染時的EBNA1蛋白表達是由Qp啟動，因此我們研究了突變型Qp與鼻咽癌的相關(guān)性。我們從鼻咽癌組織與健康人外周血標本的DNA中用PCR方法分別擴增出Qp序列并測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與B95.8原型相比，鼻咽癌中Qp啟動子有兩個位點常常發(fā)生點突變，即：62225位點g→a突變，62422位點

11、g→c突變，而且在病例與健康人標本中的突變率有差異。通過熒光素酶報告基因活性檢測和染色質(zhì)免疫共沉淀實驗，我們探討了Qp啟動子突變的功能學(xué)意義。 2.研究方法： 構(gòu)建了各種亞型EBNA1的表達質(zhì)粒和含F(xiàn)R的熒光素酶報告質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HaCat、CNE—2和293細胞；采用Westernblot證實EBNA1的在上皮細胞內(nèi)表達、熒光素酶活性實驗研究各亞型EBNA1對質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活能力和凝膠遷變實驗探討V—valEBNA1與原型E

12、BNA1同F(xiàn)R的結(jié)合力強弱。 采用PCR的方法擴增鼻咽癌石蠟標本和健康成人外周血標本中的Qp片段并測序分析突變與鼻咽癌的相關(guān)性，構(gòu)建各亞型Qp的熒光素酶報告質(zhì)粒來探討啟動轉(zhuǎn)錄的活性，采用染色質(zhì)免疫共沉淀實驗探討突變型與原型Qp與Sp1的結(jié)合力。 3.研究結(jié)果： Westernblot證實了EBNA1的表達載體在上皮細胞內(nèi)有效表達；V—valEBNA1比pp—EBNA1的轉(zhuǎn)錄活性增強，且主要是靠EBNA1蛋白的C—

13、末端突變；vv—EBNA1與FR結(jié)合力比pp—EBNA1的更強。 通過PCR擴增和測序?qū)嶒?，證實Qp的突變與鼻咽癌有密切的相關(guān)性。突變型Qp啟動轉(zhuǎn)錄的活性明顯高于原型，并且突變型Qp與Sp1的結(jié)合能力比原型Qp明顯增強。 4.結(jié)論： 鼻咽癌中V—val型EBNA1可能是通過增強與FR結(jié)合力，使得EBNA1的轉(zhuǎn)錄活性顯著增強，并且這種突變可能主要是C—末端的突變引起；V—val型EBNA1可能對于維持EB病毒的潛伏