利用RNAi技術(shù)抑制褐飛虱蔗糖酶基因和蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)子基因的研究.pdf

1、褐飛虱(Nilaparvata lugens(St(a)l)）屬同翅目(Homoptera)飛虱科(Dekphacidae)，是我國(guó)及許多亞洲國(guó)家稻區(qū)的主要害蟲。目前，防治褐飛虱的主要方法是化學(xué)防治。但是，長(zhǎng)時(shí)間使用化學(xué)農(nóng)藥帶來(lái)了農(nóng)藥殘留，環(huán)境污染和害蟲產(chǎn)生抗藥性等問(wèn)題。RNA干擾（RNA interference，RNAi）近年來(lái)迅速發(fā)展，廣泛應(yīng)用于基因功能確定、基因敲除、抗癌癥和病毒病藥物研究等方面的研究，也為病蟲害防治提供了一個(gè)新

2、的方向。
　　本論文選取了4個(gè)褐飛虱生理活動(dòng)相關(guān)基因作為靶標(biāo)基因。基于RNAi技術(shù)構(gòu)建了RNA干擾載體并轉(zhuǎn)化水稻，獲得了4種能分別表達(dá)各自靶標(biāo)dsRNA的轉(zhuǎn)基因植株。其中，2個(gè)靶標(biāo)基因是褐飛虱蔗糖酶基因（命名為145、282），2個(gè)是蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)子基因（命名為303、246）。
　　本論文采用玉米泛素啟動(dòng)子（Zea maypolyubiquitin-1 promoter, ZmUbi）指導(dǎo)dsRNA表達(dá)，用抗草甘膦基因G10ev

3、o(5-烯酮式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶，EPSPS)作為篩選標(biāo)記，構(gòu)建dsRNA的表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法將表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化粳稻品種“秀水134”，獲得了表達(dá)各自靶標(biāo)基因dsRNA的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻。
　　在T0代轉(zhuǎn)基因植株（145基因17株、282基因15株、303基因15株、246基因13株）的褐飛虱生物活性測(cè)定中，實(shí)驗(yàn)組褐飛虱數(shù)量與對(duì)照組并沒有明顯差異。雖然

4、蟲體死亡或數(shù)量減少，但大多為接蟲時(shí)的機(jī)械損傷或褐飛虱逃逸所致，轉(zhuǎn)基因植株相較對(duì)照組并沒有表現(xiàn)出褐飛虱抗性。在T0代145、282、303、246轉(zhuǎn)基因植株中，每個(gè)基因選取7個(gè)株系的種子進(jìn)行發(fā)芽，并在水稻5葉期噴施200倍的草甘膦篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。用Northern Blot的方法對(duì)陽(yáng)性植株的dsRNA表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明每個(gè)基因中均有dsRNA表達(dá)量較高的株系存在（145基因?yàn)?、7號(hào)，282基因?yàn)?、3、7號(hào)，303基因?yàn)?、

5、6號(hào)，246基因?yàn)?、5、7號(hào)）。根據(jù)Northern Blot的結(jié)果，每個(gè)基因選取3個(gè)dsRNA表達(dá)量最高的株系進(jìn)行褐飛虱生物活性測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因水稻并沒有表現(xiàn)出明顯的褐飛虱抗性。對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻T1代植株進(jìn)行Northern Blot實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)T1代植株可以表達(dá)靶標(biāo)基因的dsRNA。這說(shuō)明轉(zhuǎn)基因水稻表達(dá)dsRNA這一性狀能穩(wěn)定地遺傳至T1代，但是轉(zhuǎn)基因水稻T0和T1代都沒有表現(xiàn)出明顯的褐飛虱抗性，這可能是由于植株內(nèi)dsRNA濃度太