應(yīng)用RNAi技術(shù)抗煙草病毒及病毒檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、煙草病毒病發(fā)生普遍且危害嚴(yán)重。為從根本上防治煙草病毒病，并且快速而準(zhǔn)確地檢測(cè)出煙草上常見的四種病毒，本研究根據(jù)RNAi原理構(gòu)建了能夠產(chǎn)生發(fā)夾狀轉(zhuǎn)錄物的植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌侵染法得到轉(zhuǎn)基因煙草，并對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的抗性進(jìn)行了檢測(cè)；此外，建立了常見四種病毒的四重RT-PCR檢測(cè)方法，并對(duì)該檢測(cè)方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)和初步應(yīng)用。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.通過對(duì)GenBank中4種病毒(TMV、CMV、PVY、PVX)的多條基因組全長(zhǎng)序列進(jìn)

2、行比對(duì)，篩選到4種病毒在基因組范圍內(nèi)的相對(duì)保守區(qū)域。最終選定各病毒序列，連接成800bp的嵌合基因。依此構(gòu)建了嵌合基因的RNAi植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化普通煙草，獲得轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)PCR檢測(cè)，共得到轉(zhuǎn)化成功的植株30株，轉(zhuǎn)化成功率85.7％。轉(zhuǎn)基因植株(PCR陽性)對(duì)病毒的抗性顯著強(qiáng)于對(duì)照植株。非轉(zhuǎn)化植株和空載體轉(zhuǎn)化植株對(duì)照很快顯示病毒侵染癥狀，并且不久后死亡；轉(zhuǎn)化植株表現(xiàn)癥狀明顯遲于對(duì)照植株，接種30天后，仍有1/3的植株未顯示癥

3、狀。ELISA結(jié)果顯示，～部分PCR檢測(cè)陽性的植株對(duì)其中1至2種病毒產(chǎn)生了抗性，但沒有表現(xiàn)出同時(shí)抗3種病毒侵染的免疫特性。
　　 2.通過一系列實(shí)驗(yàn)，最終確定一步法三重RT-PCR檢測(cè)CMV、TMV和PVY的條件：Taq酶2U/25μL，MgC122mmol/L，dNTP200或250μmol/L，Tris-HCI(pH8.3)和KCI分別為15和75mmol/L;TMV、CMV引物濃度為0.04μmol/L，PVY引物濃度為0

4、.4μmol/L。退火溫度500C，循環(huán)數(shù)29或30。在三重RT-PCR的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過改變各個(gè)實(shí)驗(yàn)參數(shù)，得到了能夠同時(shí)擴(kuò)增出四種病毒(CMV、TMV、PVY和TEV)的一步法多重RT-PCR體系。后續(xù)實(shí)驗(yàn)表明，本實(shí)驗(yàn)的四重RT-PCR特異性較強(qiáng)，不會(huì)出現(xiàn)非特異條帶。同時(shí)，靈敏度實(shí)驗(yàn)表明，該四重RT-PCR的檢測(cè)靈敏度比單重RT-PCR總體上低～個(gè)數(shù)量級(jí)。對(duì)田間采集的病毒樣本的檢測(cè)表明，本實(shí)驗(yàn)得到的～步法四重RT-PCR體系能夠用于這